Insulinproduktionsteknik

Förebyggande

Insulin är ett av hormonerna som produceras av själva människokroppen, speciellt bukspottkörteln. Brott mot utsöndringen av detta ämne leder till uppkomsten av en så allvarlig sjukdom som diabetes. För dess behandling med ett syntetiskt hormon, som länge isolerats från bukspottkörteln hos boskap. Tekniken för att producera insulin med hjälp av en mycket vanlig bakterie - Escherichia coli eller jästsvamp har emellertid använts under ganska lång tid. Med hjälp av denna metod kan du undvika allergiska reaktioner orsakade av främmande protein, vilket har en liten skillnad från människa.

Tekniskt system

Insulinproduktionstekniken inkluderar alla huvudstadier av produktionen av bioteknikprodukter. Resultatet är en kristallin slutprodukt, vilken sedan används för att framställa injektionslösningar som används vid behandling av svår diabetes mellitus typ I och II. Huvudseffekten av detta hormon i kroppen manifesteras i en minskning av glukosnivåerna i blodet.

Faserna av insulinproduktion kommer att vara enligt följande:

Preliminära. Hon genomförde operationer såsom framställning och rening av luft och vatten, rengöring av industrilokaler och sterilisering av utrustning, kontrollpersonal handen bearbetning och leverans av sterilt skor och kläder. Också i det preliminära skedet görs den primära kemiska syntesen av de molekylära kedjorna från vilka proteinet är sammansatt. Kedja A innehåller 21 aminosyrarester, och kedja B innehåller 30 aminosyror.
Framställning av näringslösningar och cellodling. För att skapa en levande cell producerar den nödvändiga föreningen införs motsvarande gen. För detta skäras plasmiden genom speciella enzymer, begränsningar och generna som kodar syntesen av de nödvändiga föreningarna sys in i den. Sedan returneras den modifierade plasmiden med hjälp av en mikroinjektionsmetod till cellen.
Odling av cellsuspension. Genetiskt modifierade celler placeras i en näringslösning med alla ingredienser som är nödvändiga för tillväxt och reproduktion och genomgår sterilisering. Odlingen av kulturen sker i speciella bioreaktorer, där den förrenade luften matas. Periodiskt tillsätts en viss mängd näringslösning till reaktorn och samtidigt tas samma volym cellsuspension tillbaka.
Tilldelningen av kultur. Separationen av vätska och cellodling utförs genom sedimentering (sedimentering) i speciella sedimentatorer, och sedan filtrering, vilket möjliggör för att bevara cellernas integritet.
Kromatografisk rening av ämnet. Den utförs på lämplig utrustning, med användning av olika metoder, i synnerhet frontal, anjonbyte och gelpermeationskromatografi.
Få proteinmolekyl. Vid det faktiska bioteksteget uppträder syntesen av en oproducerad insulinmolekyl. Och de två komponenterna i dess kedjor. De sys efter oxidation och vikning av de erhållna kedjorna, vilket resulterar i bildning av disulfidbroar.
Frystorkning i en speciell ugn, varefter den resulterande kristallina beredningen kontrolleras för överensstämmelse med standarden, förpackad, märkt och skickad till konsumenten.

Vårt företag på gynnsamma villkor erbjuder färdiga produktionslinjer, där all insulinproduktionsteknik följs fullt ut. Tack vare noggranna beräkningar, tekniskt och informationsstöd, samt personalutbildning inom ramen för ett omfattande program, kommer företaget att vara lönsamt och dess produkter kommer att vara efterfrågade.

Typer av insulin och metoder för dess produktion

1. Typer av insulin

2. Få insulin

Insulin (från latinska Insula-ön) är ett peptidhormon som bildas i betacellerna i Langerhans pankreatiska öar. Det har en mångfacetterad effekt på metabolism i nästan alla vävnader.

Insulinens huvudsakliga funktion är att säkerställa permeabiliteten hos cellemembran för glukosmolekyler. I en förenklad form kan vi säga att det inte bara är kolhydrater, men också näringsämnen delas upp i glukos, som används för att syntetisera andra kolhaltiga molekyler, och är den enda typen av bränsle för cellulära kraftverk - mitokondrier. Utan insulin sjunker permeabiliteten hos cellmembranet till glukos 20 gånger, och cellerna dör av svält och det överskott av socker som upplöses i blodet förgiftar kroppen.

Insulinsekretionsnedbrytning på grund av beta-cellförstöring - absolut insulinbrist - är ett nyckelelement i patogenesen av typ 1 diabetes mellitus. Brott mot effekten av insulin på vävnad - relativ insulinbrist - har en viktig plats vid utvecklingen av typ 2-diabetes.

Insulins upptäckts historia är associerad med namnet på den ryska läkaren I.M. Sobolev (andra hälften av 1800-talet), som visade att nivån på socker i humant blod regleras av ett speciellt hormon i bukspottkörteln.

År 1922 introducerades insulin isolerat från bukspottkörteln hos ett djur först till en tioårig diabetikerpojke. Resultatet översteg alla förväntningar, och ett år senare släppte det amerikanska företaget Eli Lilly den första animaliska insulinberedningen.

Efter att ha fått den första industriella satsen av insulin de närmaste åren har ett enormt sätt att isolera och rensa blivit täckt. Som ett resultat blev hormonet tillgängligt för patienter med typ 1-diabetes.

År 1935 optimerade danska forskaren Hagedorn insulininsatsen i kroppen genom att föreslå en långvarig medicinering.

De första insulinkristallerna erhölls 1952, och 1954 dechifierade den engelska biokemisten G.Senger de insulinets struktur. Utvecklingen av metoder för rening av hormonet från andra hormonella substanser och produkter med insulinnedbrytning gjorde det möjligt att erhålla homogent insulin, kallat ettkomponent insulin.

I början av 70-talet gg. Sovjetforskare A. Yudaev och S. Shvachkin föreslog kemisk syntes av insulin, men genomförandet av denna syntes i industriell skala var dyr och olönsam.

I framtiden var det en gradvis förbättring av renhetsgraden av insuliner, vilket minskade problemen som orsakades av insulinallergier, nedsatt njurfunktion, synnedgång och immuninsulinresistens. Det mest effektiva hormonet behövdes för substitutionsbehandling i diabetes mellitus - homologt insulin, det vill säga humant insulin.

På 80-talet gjorde framsteg inom molekylärbiologi det möjligt att syntetisera båda humana insulinkedjor med användning av E. coli, vilka sedan kopplades till en biologiskt aktiv hormonmolekyl, och rekombinant insulin erhölls vid Institutet för bioorganisk kemi hos den ryska vetenskapsakademin med användning av genetiskt modifierade E.coli-stammar.

Användningen av affinitetskromatografi reducerade signifikant innehållet av förorenande proteiner i preparatet med en högre molekylvikt än insulin. Sådana proteiner innefattar proinsulin och partiellt klyvda proinsuliner, vilka kan inducera framställning av antiinsulinantikroppar.

Användningen av humaninsulin från början av behandlingen minimerar förekomsten av allergiska reaktioner. Humant insulin absorberas snabbare och, oavsett form av läkemedlet, har en kortare verkningsaktivitet än animaliskt insulin. Mänskliga insuliner är mindre immunogener än fläsk, särskilt blandade bovina och svampinsuliner.

1. Typer av insulin

Insulinpreparaten skiljer sig åt i reningsgraden; mottagningskälla (nötkreatur, svin, människa) ämnen som tillsätts till insulinlösningen (förlängning av dess verkan, bakteriestat etc.); koncentration; pH-värde; möjligheten att blanda ICD med SDI.

Insulinpreparaten varierar per källa. Svin och bovint insulin skiljer sig från människa i aminosyrasammansättning: bovin i tre aminosyror och svin i en. Det är inte överraskande att biverkningar vid behandling med bovint insulin utvecklas mycket oftare än vid behandling med svin eller humant insulin. Dessa reaktioner uttrycks i immunologisk insulinresistens, insulinallergi, lipodystrofi (förändring av subkutant fett på injektionsstället).

Trots de uppenbara nackdelarna med bovint insulin, används det fortfarande allmänt i världen. Men immunologiskt är bristerna av nötkreatinsinsufficiens uppenbara: det är under inga omständigheter rekommenderat att förskriva det till patienter med nyligen diagnostiserad diabetes mellitus, gravida kvinnor eller kortvarig insulinbehandling, till exempel under perioperativperioden. Negativa kvaliteter av bovint insulin är också bevarade när de används i en blandning med fläsk, så blandade insuliner (fläsk + bovin) bör inte användas för behandling av dessa kategorier av patienter.

Humana insulinpreparat för kemisk struktur är helt identiska med humant insulin.

Huvudproblemet med den biosyntetiska metoden för att erhålla humaninsulin är den fullständiga reningen av slutprodukten från de minsta föroreningarna hos de använda mikroorganismerna och deras metaboliska produkter. Nya metoder för kvalitetskontroll säkerställer att humana biosyntetiska insuliner från ovanstående tillverkare är fria från skadliga föroreningar. Således uppfyller deras reningsgrad och glukosänkningseffektivitet de högsta kraven och är nästan lika. Eventuella oönskade biverkningar, beroende på föroreningarna, har dessa läkemedel inte insulin.

För närvarande används tre typer av insuliner i medicinsk praxis:

- kortdistans med snabb inverkan av effekten;

- genomsnittlig verkningsaktivitet

- långverkande med långsam effekt.

Tabell 1. Karakteristik av kommersiella insulinpreparat

Kortverkande insulin (ICD) - vanligt insulin - är ett kortverkande kristallint zinkinsulin som är lösligt vid neutralt pH, vars effekt utvecklas inom 15 minuter efter subkutan administrering och varar 5-7 timmar.

Det första långvariga insulinet (SDI) skapades i slutet av 30-talet, så att patienter kunde göra injektioner mindre ofta än de gjorde när man använde ICD ensam, om möjligt en gång om dagen. För att öka varaktigheten av åtgärden modifieras alla andra insulinpreparat och, när de löses i ett neutralt medium, bildar en suspension. De innehåller protamin i fosfatbuffert - protaminzinkinsulin och NPH (neutral protamin Hagedorn) - NPH-insulin eller olika zinkkoncentrationer i acetatbuffert - insulin ultralent, tejp, seventil.

Medellånga insulinpreparat innehåller protamin, vilket är ett protein av medelvärdet m. 4400, rik på arginin och härledd från regnbågsöringsmjöl. För bildandet av komplexet krävs ett förhållande mellan protamin och insulin 1:10. Efter subkutan administrering förstör proteolytiska enzymer protamin, vilket möjliggör absorption av insulin.

NPH-insulin förändrar inte den farmakokinetiska profilen för regulatorisk insulin blandat med den. NPH-insulin är att föredra för insulinband som en komponent av den genomsnittliga verkningsaktiviteten i terapeutiska blandningar innehållande regelbundet insulin.

I fosfatbufferten bildar alla insuliner lätt kristaller med zink, men endast bovin insulinkristaller är tillräckligt hydrofoba för att ge en långsam och stabil frisättning av insulinkaraktäristiska för ultralenta. Zinkkristaller av svinsinsulin löser sig snabbare, effekten kommer tidigare, varaktigheten av åtgärden är kortare. Därför finns det ingen ultralent läkemedel som endast innehåller svinsulin. Monokomponent-svampinsulin framställs under namnet insulin-suspension, insulinneutral, insulinisofan, insulinaminokinurid.

Insulintape är en blandning av 30% insulin av semilenten (amorf insulinfällning med zinkjoner i acetatbuffert, vars effekt dissipieras relativt snabbt) med 70% insulin-ultralent (dåligt lösligt kristallint zinkinsulin, som har fördröjd start och förlängd verkan). Dessa två komponenter ger en kombination med relativt snabb absorption och stabil långsiktig verkan, vilket gör insulinbandet ett lämpligt terapeutiskt medel.

2. Få insulin

Humant insulin kan produceras på fyra sätt:

1) fullständig kemisk syntes

2) extraktion från en persons pankreas (båda dessa metoder är inte lämpliga på grund av ineffektivitet: otillräcklig utveckling av den första metoden och brist på råmaterial för massproduktion med den andra metoden);

3) genom en semisyntetisk metod med användning av en enzym-kemisk substitution vid position 30 i B-kedjan av aminosyraalaninen i grisinsulin med treonin;

4) biosyntetisk metod för gentekniksteknik. De två sista metoderna tillåter att erhålla humaninsulin med hög renhet

För närvarande erhålls humant insulin huvudsakligen på två sätt: genom att modifiera fläskinsulin genom en syntetisk-enzymatisk metod och genom en genteknikmetod.

Insulin var det första proteinet som erhölls för kommersiella ändamål med användning av rekombinant DNA-teknik. Det finns två huvudsakliga metoder för att erhålla genetiskt manipulerat humant insulin.

I det första fallet producerar separata (olika producentstammar) båda kedjorna följt av vikningen av molekylen (bildandet av disulfidbroar) och separation av isoformer.

I det andra preparatet i form av en prekursulin (proinsulin) följt av enzymatisk uppdelning med trypsin och karboxipeptidas B till hormonets aktiva form. Det mest föredragna för närvarande är att erhålla insulin som en föregångare, vilket säkerställer korrekt tillslutning av disulfidbroar (vid separat produktion av kedjor, successiva cykler av denaturering, separation av isoformer och renaturering utförs).

I båda tillvägagångssätt är det möjligt både individuellt att erhålla startkomponenterna (A- och B-kedjor eller proinsulin) och som en del av hybridproteiner. Förutom A- och B-kedjor eller proinsulin kan det finnas närvarande i kompositionen av hybridproteiner:

- proteinbärare, som tillhandahåller transport av hybridproteinet i det periplasmatiska utrymmet hos cellen eller odlingsmediet;

- affinitetskomponent, vilket underlättar valet av ett hybridprotein väsentligt.

Samtidigt kan båda dessa komponenter vara närvarande samtidigt i hybridproteinets sammansättning. Dessutom kan principen om multidimensionalitet användas vid hybridisering av proteiner (det vill säga flera kopior av målpolypeptiden är närvarande i hybridproteinet) vilket gör det möjligt att avsevärt öka utbytet av målprodukten.

I Storbritannien syntetiserades båda humana insulinkedjor med användning av E. coli, vilka sedan kopplades till en biologiskt aktiv hormonmolekyl. För att en encellell organism ska kunna syntetisera insulinmolekyler på dess ribosomer är det nödvändigt att tillhandahålla det med det nödvändiga programmet, det vill säga att introducera hormongenen för den.

Kemiskt få genframkallande biosyntesprekursor av insulin eller två gener, och programmera separat biosyntesen av insulinkedjorna A och B.

Nästa steg är införandet av genen för insulinprekursor (eller kedjegener separat) i genomet av E. coli, en speciell stam av E. coli odlad under laboratoriebetingelser. Denna uppgift utförs av genteknik.

Plasmiden isoleras från E. coli med motsvarande restriktionsenzym. Den syntetiska genen införs i en plasmid (kloning med den funktionellt aktiva C-terminala delen av P-galaktosidas E. coli). Som ett resultat förvärvar E.coli förmågan att syntetisera en proteinkedja bestående av galaktosidas och insulin. Syntetiserade polypeptider klyvs kemiskt från enzymet och renas därefter. I bakterier syntetiseras cirka 100 000 insulinmolekyler per bakteriecell.

Naturen hos hormonämnet som produceras av E. coli bestäms av vilken gen som införs i genomet hos den encelliga organismen. Om insulinprekursorgenen klonas, syntetiserar bakterien insulinprekursorn, vilken sedan utsätts för restriktionsenzymbehandling för att avlägsna fördjupningen med isoleringen av C-peptiden, vilket resulterar i biologiskt aktivt insulin.

För erhållande av renat humant insulin utsätts hybridproteinet isolerat från biomassa för kemisk-enzymatisk transformation och motsvarande kromatografisk rening (primär, gel-penetrerande, anjonbytning).

Rekombinant insulin erhölls vid Institute of RAS med användning av genetiskt konstruerade E. coli-stammar. En prekursor, ett hybridprotein uttryckt i mängden 40% av det totala cellulära proteinet, innehållande preproinsulin, frigörs från den odlade biomassan. Dess transformation till insulin in vitro sker i samma sekvens som in vivo - den ledande polypeptiden klyvs, preproinsulin omvandlas till insulin genom oxidativa sulfitolyssteg, följt av reduktiv slutning av tre disulfidbindningar och enzymatisk isolering av C-peptidbindningen. Efter en serie kromatografiska reningar, inklusive jonbyte, gel och HPLC, erhålles humant insulin med hög renhet och naturlig aktivitet.

En stam med en plasmid-inbäddad nukleotidsekvens som uttrycker ett fusionsprotein kan användas, vilket består av linjärt proinsulin och Staphylococcus aureus protein fragment A fäst vid dess N-terminus.

Odling av den mättade biomassen av celler i den rekombinanta stammen säkerställer starten av produktion av hybridproteinet, varvid isoleringen och sekventiell omvandling av dessa i rör leder till insulin.

Ett annat sätt är också möjligt: det visar sig i ett bakteriellt expressionssystem ett fusionsrekombinant protein bestående av humant proinsulin och en polyhistidin-svans som är fäst vid den via en metioninrest. Det isoleras med användning av kelatkromatografi på Ni-agaroskolonner från inklusionskroppar och digereras med cyanogenbromid.

Det isolerade proteinet är S-sulfonerat. Kartläggningen och masspektrometrisk analys av det erhållna proinsulinet, renat genom jonbyteskromatografi på anjonbytare och RP (omvänd fas) HPLC (högprestanda vätskekromatografi) visar närvaron av disulfidbroar motsvarande disulfidbroarna från nativt humant proinsulin.

Nyligen har noggrannhet gjorts för att förenkla förfarandet för att producera rekombinant insulin genom gentekniska metoder. Exempelvis är det möjligt att erhålla ett fusionsprotein bestående av ledpeptiden av interleukin 2 fäst vid proinsulinens N-ände via en lysinrest. Proteinet uttrycks effektivt och lokaliseras i inklusionskroppar. Efter isolering klyvs proteinet med trypsin för framställning av insulin och C-peptid.

Det resulterande insulinet och C-peptiden renades genom RP HPLC. När man skapar fusionsstrukturer är massförhållandet mellan bärarproteinet och målpolypeptiden väldigt signifikant. C-peptiderna är kopplade med huvudstegsprincipen med användning av aminosyraravstånd som bär Sfi I-restriktionsstället och två argininrester i början och i slutet av distansorganet för efterföljande klyvning av proteinet med trypsin. HPLC-klyvningsprodukter visar att klyvningen av C-peptiden är kvantitativ och detta gör det möjligt att använda metoden för multimera syntetiska gener för att erhålla målpolypeptider i industriell skala.

Diabetes mellitus är en kronisk sjukdom som orsakas av absolut eller relativ insulinbrist. Det kännetecknas av en djup metabolisk störning av kolhydrater med hyperglykemi och glukosuri, liksom andra metaboliska störningar som ett resultat av ett antal genetiska och yttre faktorer.

Insulin hittills tjänar som en radikal och i de flesta fall det enda sättet att upprätthålla liv och funktionshinder hos personer med diabetes. Innan mottagning och introduktion av insulin till kliniken 1922-1923. Patienter med diabetes mellitus typ I väntade på ett dödligt utfall i ett till två år från sjukdomsuppkomsten, trots att de mest uttömda dieterna användes. Patienter med diabetes mellitus typ I behöver livslång ersättningsbehandling med insulin. Uppsägning på grund av olika orsaker till den regelbundna introduktionen av insulin leder till den snabba utvecklingen av komplikationer och patientens omedelbara död.

För närvarande är diabetes vad gäller prevalens på 3: e plats efter hjärt-kärlsjukdomar och onkologiska sjukdomar. Enligt Världshälsoorganisationen är förekomsten av diabetes bland den vuxna befolkningen i de flesta regioner i världen 2-5% och det finns en tendens att öka antalet patienter nästan två gånger vart 15 år. Trots de uppenbara framstegen inom hälsovården ökar antalet insulinberoende patienter varje år och i själva verket är det bara omkring 2 miljoner människor i Ryssland.

Skapandet av droger av inhemskt humant genetiskt insulin öppnar nya möjligheter att lösa många problem med diabetologi i Ryssland för att rädda livet för miljontals människor med diabetes.

Bioteknik: Handbok för gymnasier / red. NS Egorova, V.D. Samuilova.- M.: Higher School, 1987, s. 15-25.

Geneteknik mänskligt insulin. Förbättrad effektivitet för kromatografisk separation med användning av principen om bifunktionalitet. / Romanchikov, A.B., Yakimov, S.A., Klyushnichenko, V.E., Arutunyan, A.M., Vulfson, A.N. // Bioorganic Chemistry, 1997-23, nr 2

Glick B., Pasternak J. Molecular biotechnology. Principer och tillämpning. M.: Mir, 2002.

Egorov N. S., Samuilov V. D. Moderna metoder för att skapa industriella stammar av mikroorganismer // Bioteknik. Vol. 2. M.: Higher School, 1988. 208 s.

Immobilisering av trypsin och karboxipeptidas B på modifierad kiseldioxid och deras användning vid omvandling av rekombinant humant proinsulin till insulin. / Kudryavtseva N.E., Zhigis L.S., Zubov V.P., Vulfson A.I., Maltsev K.V., Rumsh L.D. // Kemiska läkemedel. J., 1995 - 29, nr 1, sid. 61-64.

Molekylärbiologi. Strukturen och funktionen av proteiner. / Stepanov V. M. / / Moscow, High School, 1996.

Grunderna för farmaceutisk bioteknik: Studiehandbok / ETC. Prishchep, V.S. Chuchalin, K.L. Zaikov, L.K. Mikhalev. - Rostov-mot-Don.: Phoenix; Tomsk: Publishing House NTL, 2006.

Syntes av insulinfragment och studier av deras fysikalisk-kemiska och immunologiska egenskaper. / Panin L.E., Tuzikov F.V., Poteryaeva ON, Maksyutov A.Z., Tuzikova N.A., Sabirov A.N. // Bioorganic Chemistry, 1997-23, nr 12, sid. 953-960.

Regler för produktion av genetiskt modifierad insulin

Hem> Presentation> Medicin, Hälsa

Statlig utbildningsanstalt

högre yrkesutbildning

Kursk State Medical University

Federala byrån för hälsa och social utveckling

Institutionen för farmaceutisk teknik

för att erhålla genetiskt modifierat insulin med användning av rDNA bioteknik

5: e årsstudent 5 grupper

Ph.D., seniorlärare Maravina I.N.

Avsnitt I. Egenskaper hos slutprodukten 3

Avsnitt II. Egenskaper hos råmaterial 5

Avsnitt III. Kemisk produktionsschema 6

Avsnitt IV. Teknisk produktionsplan 7

Avsnitt V. Produktionsflödesschema och specifikation

Avsnitt VI. Processförklaring 10

Avsnitt VII. Analysmetoder 14

Avsnitt VIII. Säkerhet, brandsäkerhet,

industriell sanitet 16

Avsnitt IX. Förteckning över produktionsanvisningar 17

Avsnitt I. Egenskaper för slutprodukten

Torrinsulinbiomassa

Beskrivning. Insulinlösningar är en klar, färglös eller något gulaktig sur vätska (pH 2,0-3,5), som framställs genom att späda kristallint insulin i vatten surgjord med saltsyra med tillsats av glycerol och 0,25-0,30% fenol eller tricresollösning för konservering.

Hypoglykemiskt medel, kortverkande insulin. Samverkar med en specifik receptor i cellens yttre membran och bildar ett insulin-receptorkomplex. Genom aktivering av cAMP-biosyntes i fettceller och leverceller eller direkt penetrerande muskelceller stimulerar insulin-receptorkomplexet intracellulära processer, inklusive syntes av ett antal nyckel enzymer (hexokinas, pyruvatkinas, glykogensyntetas etc.). Minskningen av blodglukos beror på en ökning av dess intracellulära transport, ökad absorption och absorption av vävnader, stimulering av lipogenes, glykogenogenes, proteinsyntes, minskning av leverans glukosproduktionshastighet etc. Insulinberedningens verkningsgrad beror huvudsakligen på absorption faktorer (från en dos, en metod och ett injektionsställ). Efter p / till början av effekten - efter 0,5 h, den maximala effekten - efter 1-3 timmar, varaktigheten av åtgärden - 8 timmar.

Typ 1 diabetes mellitus (insulinberoende). Typ 2 diabetes mellitus (icke-insulinberoende): resistenssteg mot orala hypoglykemiska medel, partiell resistens mot dessa läkemedel (under kombinationsbehandling), samtidiga sjukdomar, graviditet.

I början av behandlingen - synfel, svullnad i benen. Med införandet av för stora doser insulin eller en kränkning av kosten (hoppar över måltider), liksom överdriven motion, hypoglykemi (kall svett, blek hud, nervositet, tremor, ångest, överdriven trötthet eller svaghet, desorientering, yrsel, huvudvärk, uttalad känsla av hunger, tillfällig synskada, illamående, takykardi, i allvarliga fall - förlust av medvetenhet, koma). Systemiska allergiska reaktioner: ökad svettning, kräkningar, andningssvårigheter, hjärtklappning, yrsel.

Hållbarhet - 1 år från tillverkningsdatum.

Avsnitt II. Egenskaper hos råmaterial

Kedjor av gener som kodar syntesen av kedjorna A och B

Kemiskt syntetiserad

Kultur måste vara ren

Fyra lager papperspåsar

Tyger av bomullsband

Avsnitt III. Kemisk produktionsschema

Kemiska omvandlingar vid framställning av genetiskt modifierat insulin är frånvarande.

Avsnitt IV. Tekniskt system för framställning av insulin

Förberedelse av lokaler och utrustning

Sanitetsbearbetningsproduktion

Förberedelse av tekniska kläder

Syntes av kedjorna A och B

Införandet av gener i plasmiden

Introduktion av r-DNA i permissiv cellen

Näringsberedning

Odlingsuppskovningskultur

Få insulinmolekyl

Enligt FS-indikatorer

Instrumentalt produktionsschema och utrustningsspecifikation

1 - Kemisk reaktor

2 - Införandet av gener i plasmiden

4 - Kontinuerlig steriliseringsenhet

5 - Industriell bioreaktor

6 - Urval av kedjor

7 - Kromatografisk installation

8 - få insulinmolekyl

9 - Frys Torkare

10 - Analytisk tabell

Avsnitt VI. Processbeskrivning

BP 1. Vattenberedning

Membran destillatörer är utformade för att få avsaltat vatten som uppfyller kraven i GOST 6709-97 "Destillerat vatten". Destilleringsproduktivitet - från 3 till 15 l / timme (laboratorieinstallationer i ekonomisk komplett uppsättning) och även 5-30 l / h (laboratorieinstallationer). Filtreringsprocessen innefattar följande steg: förbehandling på aktivt kol, membranfiltrering och avjonisering av vatten med användning av jonbytarhartser. Förfiltret avlägsnar suspenderade partiklar, klor, högmolekylär organisk material och tungmetalljoner från inkommande kranvatten. Membranfiltrering baseras på fenomenet omvänd osmos, i vilken vatten, när det passerar genom ett semipermeabelt membran, renas från salter upplöst i det, organiska orenheter med låg molekylvikt, såväl som bakterier och mikroorganismer. På filtret med jonbytarhartser finns en fullständig rening av filtratet från upplösta salter.

BP 2. Sanitär bearbetning av produktion.

BP 2.1. Följande krav ställs på plats för tillverkning av sterila doseringsformer:

Måste hållas i oklanderlig renhet, föremål för obligatorisk daglig såväl som allmän städning och periodiska reparationer.

Kan utsättas för UV-strålning för luftdesinfektion med stationära eller bärbara strålningsanordningar;

Måste ha belysning, temperatur, luftfuktighet och ventilation som inte har någon direkt eller indirekt negativ inverkan på kvaliteten på färdiga produkter.

Måste innehålla det minimum som är nödvändigt för produktionsprocessens utförande mängden utrustning och möbler

Parningen mellan väggar, golv och tak måste ha en rundad form;

I lokalerna i I och II klasser av renlighet bör det inte finnas någon öppen kommunikation, luftkanaler;

Lokaler av en högre klass av renlighet bör placeras i ett rum med en lägre klass av renlighet. Personalen och råvarans tillgång till ett renrum utförs endast genom luftportar, som är försedda med tillförsel av steril luft enligt "topp-ner" -systemet.

Överföringen av den färdiga produkten måste utföras med hjälp av en transportör som passerar genom väggarna.

BP 2.2. Utrustning förberedelse

Krav på utrustningens förberedelse:

Utrustningen måste utformas och placeras på ett sådant sätt att dess drift, underhåll och reparationer kan utföras utanför de "rena" lokalerna.

Utrustning som används vid aseptiska förhållanden måste ha inspelningsenheter för övervakning av processparametrar och förekomst av larmanordningar för funktionsfel.

Utrustningen måste rengöras, desinficeras och om nödvändigt steriliseras.

Utrustningen måste övervakas för mikrobiologisk renhet.

Arbetsytan på utrustningen ska vara jämn, från giftfritt och icke-frätande material.

BP 2.3. Personalutbildning

Krav på personal:

Personalen måste ha viss viss kunskap om hygien, sanitet och GMP-regler.

Medarbetare med infektionssjukdomar, öppna sår på huden och bärare av patogen mikroflora får inte arbeta.

Det är förbjudet att prata, äta mat, flytta snabbt på arbetsplatsen;

Strikt följa personlig hygien, ta bort kosmetika från ansiktet och ta bort smycken innan du går in i "ren" rummet;

Ta en dusch, tvätta och rengör dina händer med desinfektionsmedel, sätt på en uppsättning sterila tekniska kläder och skor.

BP 3. Syntes av kedjorna A och B.

Syntes av kedjor utförs med en kemisk metod. Kedja A innehåller 21 aminosyrarest, kedja B-30 rester

BP 4. Införandet av gener i plasmiden.

För att plasmiden ska acceptera en aliengen, skäras dess kedja med restriktionsenzymer. För koppling av generna som kodar syntesen av kedjorna A och B används oligosackaridrester av olika längder - länkare och adaptrar. När molekylen är stängd kan du komma in i en permissiv cell.

BP 5. Introduktionen av r-DNA i den permissiva cellen.

Introduktion av p = DNA i en E. coli-cell utförs genom mikroinjektion: ett plasmidinnehållande vektor-DNA injiceras i en E. coli-cell med en speciell ultratenn glasnål.

TP 6. Framställning av näringsmedium

Huvudnäringsmediet för odling av E. coli-kultur är buljong enligt Miller. Ingredienser: kaseinhydrolysat, jästextrakt, natriumklorid, agar-agar. Det slutliga pH-värdet (vid 25 ° C) är 7,0 ± 0,2. Hottinger buljong används också. Ingredienser: Hottingerhydrolysat, natriumklorid, destillerat vatten.

Sterilisering av näringsmediet utförs i en maskin för kontinuerlig sterilisering - ONS. Näringsmediet passerar successivt genom uppvärmningssektionen, hållarsektionen och kylsektionen.

TP 7. Odling av suspensionskultur

Biokulturodling utförs i bioreaktorer, suspensionskultur där blandas på grund av tillförsel av luft i bioreaktorn. Processen utförs i semi-periodiskt läge, när en viss mängd friskt näringsmedium kontinuerligt tillsätts bioreatorn och samtidigt tas samma volym cellsuspension.

TP 8. Isolering av vävnadsodling.

Separationen av vävnadsodling från näringsmediet utförs genom sedimenteringsmetoden (sedimentering) i sedimentorer, en djupare separation ges genom filtrering av en mild metod för att bevara kulturcellernas integritet.

Insulin renas genom kromatografimetoder: frontal, gelpermeation, anjonbyte. Rening av insulin och dess derivat på sorbenter med starka katjonbytningsegenskaper (till exempel SP-Sepharose FF) kan användas buffersystem baserade på ammoniumacetat med ett lågt innehåll av karbamid (upp till 2 M eller mindre).

TP 10. Få insulinmolekyl

Utvalda och renade kedjor viks och oxideras, vilket säkerställer bildandet av lämpliga disulfidbroar.

Torkning av produkten utförs i en frystorkare.

TP 12. Utvärdering av färdig produktens kvalitet.

Utseende (som beskrivet), aktivitet (biologisk metod).

UMO 13. Förpackning, märkning, leverans.

Insulinaktiviteten mäts i verkningsenheter (ED) eller i internationella aktionsenheter (IU - Ryska eller IU - engelska eller UI - franska). 1 enhet motsvarar aktiviteten av 1/24 mg (41,66 μg) kristallint insulin.

1922 föreslog Frederick Banting att insulinverkningsenheten skulle betraktas som antalet kubikcentimeter av bukspottkörtelkrement som förde en hälsosam kanin till hypoglykemi med en SC-nivå på 2,5 mmol / l i 2-4 timmar. Lite senare samma år föreslog samma lag en "mus" -enhet - mängden insulin som behövdes för att få hälften av den experimentella gruppen av möss till konvulsioner (forskarna här handlade initialt analogt med LD50).

Följande år antog den internationella standardiseringsnämnden definitionen av insulinsegmentenheten: "Mängden insulin som krävs för att sänka blodsockernivån till den nivå vid vilken anfall börjar hos kaniner som väger 2 kg och inte får mat inom 24 timmar." Denna enhet, till ära av Toronto-gruppen av Banting och Best, namngavs Toronto-insatsenheten.

År 1925 introducerades den första internationella standarden, vilken fastställde att en enhet av insulinverkan är en mängd som motsvarar 1/8 mg kristallint insulin.

På grund av de stora framstegen i insulinrening och besväret med att använda en sådan stor enhet 1936 godkände FN: s kommitté en ny internationell standard för insulininsats som motsvarade enheten till 1/22 mg kristallint insulin. År 1952 ändrades standarden igen och 1 enhet likställdes med 1 / 24,5 mg kristallint insulin, och 1958 uppträdde den fjärde standarden (1 U är lika med 1/24 mg kristallint insulin). Den som 1982 lade fram de senaste anpassningarna av standarden, som inte påverkade definitionen av enheten, men endast gällde de förändringar som var förknippade med framväxten av human genetiskt manipulerat insulin.

Avsnitt VIII. Säkerhet, brandsäkerhet och

Varje arbetare och maskinarbetare vid mottagandet av arbetet måste genomgå en primärinstruktion. Primär briefing utförs av förmannen eller mästaren enligt följande program:

De viktigaste bestämmelserna i lagstiftningen om arbetarskydd, säkerhet, industriell hygien

Syftet med och förfarandet för användning av speciell klädsel och personlig skyddsutrustning.

Plikt på arbetsplatsen;

Krav på korrekt organisation och underhåll av arbetsplatsen

Allmänna elektriska säkerhetsregler, värdet av ventilation och regler för användning av ventilationssystem.

Känna till den tekniska processen, enhetsutrustning och alla farliga föremål.

All elektrisk utrustning måste uppfylla kraven i "Regler för drift av elektrisk utrustning". Elektrisk utrustning måste jordas. Alla produktions- och tvättstugor, installationer, anläggningar ska vara försedda med brandsläckningsutrustning och brandbekämpningsutrustning.

Inträde för obehöriga i butiken är förbjuden.

Avsnitt IX. Förteckning över produktionsanvisningar

Arbetsinstruktioner för sanitär behandling av lokaler.

Instruktioner för säkerhet, industriell hygien och brandsäkerhet.

Instruktioner för förberedelse, leverans och kvitto av reparation av utrustning.

Instruktioner för hur man får råmaterial och hjälpmedel;

Olyckshändelser.

Instruktioner för regenerering av lösningen.

Arbetsinstruktioner för operatören av tvätt, torkning och sterilisering av flaskor.

Instruktioner för mekanik för reparation och underhåll av rörledningar.

Insulinproduktionsteknik

INSULIN.docx

Kapitel 1. Litterär granskning

1,3. Sprutor, pennpennor och insulindisplayer

1.4 Insulininjektionsteknik.............................................

1.5.Faktorer som påverkar insulinabsorption och verkan.........

1,6. Komplikationer av insulinbehandling............................................

1,7. Insulinförpackning

1,8. Insulinförvaring.

1,9. Moderna sätt att förbättra insulinbehandling.....

Kapitel 2. Experimentell del

Insulin (från det latinska. Insula - ön) - ett peptidhormon, bildas i betacellerna i lankhansarna i bukspottkörteln. Det har en mångfacetterad effekt på metabolism i nästan alla vävnader.

Antalet personer med diabetes över hela världen är 120 miljoner (2,5% av befolkningen). Varje 10-15 år fördubblas antalet patienter. Enligt International Diabetes Institute (Australien) kommer 2010 att finnas 220 miljoner patienter i världen. I Ukraina finns cirka 1 miljon patienter, varav 10-15% drabbas av den mest allvarliga insulinberoende diabetes (typ I). Faktum är att antalet patienter är 2-3 gånger på grund av dolda, odiagnostiserade former.

År 1935 optimerade danska forskaren Hagedorn insulininsatsen i kroppen genom att föreslå en långvarig medicinering.

I början av 70-talet gg. Sovjetforskare A. Yudaev och S. Shvachkin föreslog kemisk syntes av insulin, men genomförandet av denna syntes i industriell skala var dyr och olönsam.

Syftet med mitt arbete: Studien av insulinpreparat som presenteras på vår marknad, deras fördelar och nackdelar.

Uppgifter: Behandlingen av processen för att erhålla insulin i industriproduktionen.

Kapitel 1. Litterär granskning

1.1 Få insulin

Humant insulin kan produceras på fyra sätt:

1) fullständig kemisk syntes

3) genom en semisyntetisk metod med användning av en enzym-kemisk substitution vid position 30 i B-kedjan av aminosyraalaninen i grisinsulin med treonin;

4) biosyntetisk metod för gentekniksteknik. De två sista metoderna tillåter att erhålla humaninsulin med hög renhet

Överväg att få insulin biosyntetiskt, vad gäller fördelarna med denna metod.

Så fördelarna med att få insulin biosyntetiskt.

Innan introduktionen av metoden för att producera insulin genom att använda rekombinanta mikroorganismer i branschen var det bara ett sätt att erhålla insulin - från bukspottkörteln hos nötkreatur och svin. Insulin som härstammar från bukspottkörteln skiljer sig från humant insulin med 3 aminosyrarester, och insulin som erhålls från gris körtel är bara en aminosyrarest, det vill säga det är närmare humant insulin. Men med införandet av proteiner som skiljer sig i struktur från humana proteiner kan även allergiska reaktioner uppstå, även i ett sådant mindre uttryck. Ett sådant insulin som ett främmande protein kan också inaktiveras i blodet av de resulterande antikropparna.

För att få 1 kilo insulin krävs 35 tusen grisar (om det är känt att det årliga behovet av insulin är 1 ton av läkemedlet). Å andra sidan kan samma mängd insulin erhållas biosyntetiskt genom biosyntes i en 25-kubisk fermentor med användning av den rekombinanta mikroorganismen Escherichia coli.

Den biosyntetiska metoden för erhållande av insulin applicerades i början av 80-talet

Låt oss fortsätta med systemet för produktion av rekombinant insulin (Eli Lilli-Eli-Lilly, Förenta staterna):

Steg 1. Genom kemisk syntes skapades nukleotidsekvenser som kodar bildandet av A- och B-kedjor, det vill säga syntetiska gener skapades.

2. etapp. Var och en av de syntetiska generna införs i en plasmid (en gensyntesiserande sträng A införs i en plasmid och en gensyntesiserande sträng B införs i den andra plasmiden).

Tredje etappen. Ange genen som kodar för bildandet av enzymet betagalaktosidas. Denna gen ingår i varje plasmid för att uppnå kraftig replikation av plasmider.

4. etapp. Plasmider introduceras i Escherichia coli cell - Escherichia coli och två producentkulturer erhålles, en kultur syntetiserar A-kedjan, den andra B-kedjan.

5 etappen. Placera två kulturer i en fermentor. På onsdag tillsätt galaktos, vilket inducerar bildandet av enzymet betagalaktosidas. I detta fall replikerar plasmider aktivt och bildar många kopior av plasmider och därför syntetiserar många gener A- och B-kedjorna.

6 steg. Cellerna lyser, utsöndrar A- och B-kedjorna, vilka är associerade med betagalaktosidas. Allt detta behandlas med cyanogenbromid och A- och B-kedjorna är klyvda från beta-galaktosidaset. Gör sedan ytterligare rening och urval av A- och B-kedjor.

7. etapp. Cysteinrester oxideras, bindas och insulin prepareras.

Insulin som erhålls genom denna rutt är humant insulin i sin struktur, vilket från början av behandlingen minimerar förekomsten av allergiska reaktioner.

För erhållande av renat humant insulin utsätts hybridproteinet isolerat från biomassa för kemisk-enzymatisk transformation och lämplig kromatografisk rening (frontal, gel-penetrerande, anjonbyte).

Ett rekombinant insulin erhölls vid Institutet för den ryska vetenskapsakademin genom att använda genetiskt konstruerade E. coli-stammar, metoden består i syntesen av dess biologiska föregångare av proinsulin, vilket gör det möjligt att inte utföra den separata syntesen av insulin A- och B-kedjor. För framställning av proinsulindelen av molekylen i E. coli. plasmiden introduceras (den erhålls genom införande av naturligt eller främmande DNA - detta är hur en rekombinant RNA-molekyl erhålles). Plasmiden tillhandahåller syntesen av rekombinant protein, vilket är en ledarsekvens och ett fragment av proteinet såväl som humant proinsulin med metioninrest (aminosyra) mellan dem. Proinsulindelen av molekylen separeras genom behandling med bromcyan i ättiksyra (klyvning utförs selektivt - genom metioninrest). Blandningen (proinsulin del och ledarsekvens) separeras genom kromatografi. Vid nästa steg, i den resulterande sekvensen av proinsulin, utförs det korrekta ömsesidiga arrangemanget av kedjorna A och B, vilket utförs av den centrala delen - peptid C. I nästa steg isoleras bindning C-peptiden med en enzymatisk metod. Efter en serie kromatografiska reningar, inklusive jonbyte, gel och HPLC, får jag högt renhetsintensivt humaninsulin och naturlig aktivitet.

Kvalitetskontrollen av genetiskt manipulerat insulin innebär kontroll av ytterligare indikatorer som karakteriserar stabiliteten hos den rekombinanta stammen och plasmiden, avsaknaden av främmande genetiskt material i beredningen, identiteten hos den uttryckta genen etc.

1.2 Insulinpreparat

Humana insulinpreparat för kemisk struktur är helt identiska med humant insulin.

Insulinpreparat, beroende på start och verkningsaktivitet, är indelade i följande grupper:
1) insuliner med snabb och ultralös åtgärd;
2) kortverkande insuliner ("enkla" insuliner);
3) insuliner med mellanliggande längd ("mellanliggande" insuliner);
4) långverkande insuliner;
5) "blandade" insuliner - en kombination av insuliner med olika verkningsaktivitet.

Antalet insulinpreparat med olika namn är flera dussin, och nya insulinnamn från olika utländska, och under senare år läggs inhemska läkemedelsföretag årligen.

Snabba och ultrashorta insuliner

De snabba och ultrashorta insulinerna innehåller för närvarande tre nya läkemedel - lispro (humalog), aspart (novoid, novolog) och glulissin (apidra). Deras särdrag är i snabbare början och slutet av åtgärden i jämförelse med det vanliga "enkla" personinsulinet. Den snabba uppkomsten av glukossänkningseffekten av nya insuliner beror på deras accelererade absorption från subkutant fett. Egenheterna hos nya insuliner gör det möjligt att minska tiden mellan deras injektioner och matintag, minska nivån av näringstillväxt glykemi och minska incidensen av hypoglykemi.

Läkemedlets inverkan av lispro, aspart och glulissin förekommer i intervallet 5 till 10-15 minuter, maximal effekt (åtgärdstopp) är efter 60 minuter, varaktigheten av åtgärden är 3 till 5 timmar. Dessa insuliner administreras 5 till 15 minuter före en måltid eller omedelbart före den. Det har fastställts att administrering av insulin lispro omedelbart efter en måltid ger också god glykemisk kontroll. Det är emellertid viktigt att komma ihåg att administrering av dessa insuliner 20 till 30 minuter före en måltid kan leda till hypoglykemi.

Patienter som byter till introduktionen av dessa insuliner måste kontrollera glykemiska nivåer oftare tills de lär sig att korrelera mängden kolhydrater som förbrukas och dosen av insulin. Doseringarna av läkemedel sätts således individuellt i varje enskilt fall.

Om endast Humalog (Insulin lispro) används, används en ny snabb eller nybörjare (insulin aspart) eller apidra (insulin glulisin), de kan administreras 4-6 gånger om dagen och i kombination med långverkande insuliner 3 gånger om dagen. Exceptionell dos på 40 U är tillåten i undantagsfall. Dessa insuliner, som finns i ampuller, kan blandas i samma spruta med humaninsulinpreparat med längre verkningsperioder. När detta höghastighetsinsulin samlas upp i sprutan först. Injektion är önskvärt att göra omedelbart efter blandning. Dessa insuliner framställda i patroner (speciella ärmar) är inte avsedda för framställning av blandningar med något annat insulin.

Detta är viktigt!
Nya höghastighetsinsuliner är lämpliga för patienter som leder en aktiv livsstil. Användningen rekommenderas för akuta infektioner, känslomässigt stress, ökar mängden kolhydrater i mat, tar mediciner som främjar hyperglykemi (sköldkörtelhormoner, kortikosteroider - prednisolon etc.), med andra intoleranser insulinpreparat eller post-näringsrikt hyperglykemi, vilket är dåligt mottagligt för verkan av andra insuliner. Det bör än en gång betonas att snabbverkande insuliner ska användas i direkt samband med matintag.

Insulinproduktionsteknik

Tekniskt system

Typer av insulin och metoder för dess produktion

Regler för produktion av genetiskt modifierad insulin

Hem> Presentation> Medicin, Hälsa

Insulinproduktionsteknik

INSULIN.docx

Läs Mer Om Diabetes

Symptom På Diabetes

Glykemiskt Index