Insulinproduktionsteknik

Analyser

Insulin är ett av hormonerna som produceras av själva människokroppen, speciellt bukspottkörteln. Brott mot utsöndringen av detta ämne leder till uppkomsten av en så allvarlig sjukdom som diabetes. För dess behandling med ett syntetiskt hormon, som länge isolerats från bukspottkörteln hos boskap. Tekniken för att producera insulin med hjälp av en mycket vanlig bakterie - Escherichia coli eller jästsvamp har emellertid använts under ganska lång tid. Med hjälp av denna metod kan du undvika allergiska reaktioner orsakade av främmande protein, vilket har en liten skillnad från människa.

Tekniskt system

Insulinproduktionstekniken inkluderar alla huvudstadier av produktionen av bioteknikprodukter. Resultatet är en kristallin slutprodukt, vilken sedan används för att framställa injektionslösningar som används vid behandling av svår diabetes mellitus typ I och II. Huvudseffekten av detta hormon i kroppen manifesteras i en minskning av glukosnivåerna i blodet.

Faserna av insulinproduktion kommer att vara enligt följande:

Preliminära. Hon genomförde operationer såsom framställning och rening av luft och vatten, rengöring av industrilokaler och sterilisering av utrustning, kontrollpersonal handen bearbetning och leverans av sterilt skor och kläder. Också i det preliminära skedet görs den primära kemiska syntesen av de molekylära kedjorna från vilka proteinet är sammansatt. Kedja A innehåller 21 aminosyrarester, och kedja B innehåller 30 aminosyror.
Framställning av näringslösningar och cellodling. För att skapa en levande cell producerar den nödvändiga föreningen införs motsvarande gen. För detta skäras plasmiden genom speciella enzymer, begränsningar och generna som kodar syntesen av de nödvändiga föreningarna sys in i den. Sedan returneras den modifierade plasmiden med hjälp av en mikroinjektionsmetod till cellen.
Odling av cellsuspension. Genetiskt modifierade celler placeras i en näringslösning med alla ingredienser som är nödvändiga för tillväxt och reproduktion och genomgår sterilisering. Odlingen av kulturen sker i speciella bioreaktorer, där den förrenade luften matas. Periodiskt tillsätts en viss mängd näringslösning till reaktorn och samtidigt tas samma volym cellsuspension tillbaka.
Tilldelningen av kultur. Separationen av vätska och cellodling utförs genom sedimentering (sedimentering) i speciella sedimentatorer, och sedan filtrering, vilket möjliggör för att bevara cellernas integritet.
Kromatografisk rening av ämnet. Den utförs på lämplig utrustning, med användning av olika metoder, i synnerhet frontal, anjonbyte och gelpermeationskromatografi.
Få proteinmolekyl. Vid det faktiska bioteksteget uppträder syntesen av en oproducerad insulinmolekyl. Och de två komponenterna i dess kedjor. De sys efter oxidation och vikning av de erhållna kedjorna, vilket resulterar i bildning av disulfidbroar.
Frystorkning i en speciell ugn, varefter den resulterande kristallina beredningen kontrolleras för överensstämmelse med standarden, förpackad, märkt och skickad till konsumenten.

Vårt företag på gynnsamma villkor erbjuder färdiga produktionslinjer, där all insulinproduktionsteknik följs fullt ut. Tack vare noggranna beräkningar, tekniskt och informationsstöd, samt personalutbildning inom ramen för ett omfattande program, kommer företaget att vara lönsamt och dess produkter kommer att vara efterfrågade.

Insulin upptäckt

Idag drabbar diabetes mer än 400 miljoner människor på planeten, vilket är ungefär 8% av den vuxna befolkningen i världen. Enligt statsregistret lider mer än 3,3 miljoner människor av diabetes i Ryssland (cirka 300 tusen människor lider av typ 1-diabetes och cirka 3 miljoner människor lider av typ 2-diabetes). Men dessa siffror är osannolikt att återspegla den verkliga situationen. Alla dessa människor, som lever varje dag, förstår att deras liv beror på insulin.

De första försöken att bota diabetes gjordes före vår tid. Forntida grekiska och romerska läkare som används för denna massage, gymnastik, bad, aromaterapi och mycket mer. På 1800-talet utvecklades en kolhydrat med låg kolhydrat för diabetiker. Det första försöket att behandla diabetes med insulininjektioner gjordes 1921. Kanadensisk forskare Frederick Banting blev den första personen som använde insulinhormon för att kontrollera diabetes. Han var bara 32 koder när han fick Nobelpriset i medicin. Han skapade läkemedlet effektivt och utan biverkningar sänkte glukosnivån från 28,9 till 6,7 mmol / l. Detta läkemedel gav hopp till livet för många.

1869 upptäckte forskaren Paul Langergans grupper av celler i bukspottkörteln, som senare kallades "Langerhans öar". Insulin isolerades sedan från cellerna i dessa öar. Insulin är ett hormon som reglerar metabolismen, främst av kolhydrater (sockerarter), men också fetter och proteiner. Vid diabetes på grund av otillräckliga effekterna av insulin sker komplex metabolisk störning, ökar blodsockernivåer (hyperglykemi) och socker utsöndras i urinen (glukosuri) i blodprodukter verkar sura förbrännings nedsatt fett - ketonkroppar (ketoacidos).

Efter upptäckten av insulin började många forskare utveckla metoder för rengöring av detta läkemedel, eftersom det är orenheter som har en skadlig effekt på en försvagad kropp.

Agilent Technologies är världsledande inom analysutrustning. Apparater för kromatografisk och spektralanalys i mer än ett år har hjälpt forskare runt om i världen att lösa de vitala problemen med läkemedel. Insulinrenhetskontroll är inget undantag. Tidigare användes klassisk vätskekromatografi för dessa ändamål, samtidigt som man erhöll ganska godtagbara resultat:

Efter mycket forskning visade forskare att den bildade insulinpolypeptiden med en molekylvikt av ca 6000 identifierades effektivt med användning av de senaste utvecklingen inom området exclusionskromatografi.

Med denna nya metod kan man jämföra "bra insulin", vilket lagrades under rekommenderade förhållanden och "dåligt insulin". När överlagrade två kromatogram, fann man att i en beredning av insulin, som lagras under svåra förhållanden, är målmolekylen kollapsat och i dess ställe i kromatogrammet identifierades nedbrytningsprodukter.

Utveckling och sammansättning av metoder för analys och standardisering av insulinpreparat med användning av revers-fas högtrycksvätskekromatografi (RP HPLC) Pikhtar Anatoly Vasilievich

Denna avhandling ska gå till biblioteket inom en snar framtid.
Meddela om upptagande

Avhandlingen - 480 rubel., Leverans 10 minuter, dygnet runt, sju dagar i veckan och helgdagar.

Sammanfattning - 240 rubel, leverans 1-3 timmar, från 10-19 (Moskva tid), utom söndag

Pihtar Anatoly Vasilyevich. Utveckling och sammansättning av metoder för analys och standardisering av insulinpreparat med användning av revers-fas högtrycksvätskekromatografi (RP HPLC): avhandling. Kandidat av farmaceutiska vetenskaper: 15.00.02 / Pihtar Anatoly Vasilievich; [Skyddsområde: Moscow Medical Academy "].- Moskva, 2005.- 139 s.: Il.

Innehåll för avhandlingen

KAPITEL 1. Översyn av litteraturen 11

1. Insulinens roll vid behandling av diabetes mellitus 11

2. Biosyntes och biologisk verkan av insulin 12

3. Allmänna egenskaper hos insulinens fysikalisk-kemiska och farmaceutiska egenskaper 15

4. Insulinpreparat 24

5. Produktionsmetoder, standardisering och kvalitetskontroll av insulinpreparat 31

6. Användningen av HPLC i den farmaceutiska analysen av insulin. 46

KAPITEL 2. Problemutlåtande 50

KAPITEL 3. Studie av påverkan av olika faktorer på insulinets kromatografiska beteende under betingelserna för RP HPLC 56

1. Metoder och material 57

2. Diskussion av resultaten 62

2,1. Påverkan av buffertlösningens sammansättning 62

2,2. Effekten av natriumsulfatkoncentration 68

2,3. Effekt av kromatografisk kolonnstemperatur 70

2,4. Effekt av organisk modifierare 75

2,5. Inverkan av längden av alkylradikalen i den ympade fasen 80

2,6. Påverkan av kromatografikolonnens längd 80

KAPITEL 4. Förbättra farmakopémetoderna för analys av insulinpreparat baserat på användningen av RP HPLC 82

1. Val av optimala förhållanden för kromatografisk bestämning av insulin och dess orenheter i medicinska preparat 82

2. Metrologiska egenskaper hos metoden 84

3. Tillämpning av den utvecklade metoden för testning av officiella insulinpreparat 95

KAPITEL 5. Utveckling av metoder för analys av injicerbara doseringsformer av isofan-insulin baserat på PF HPLC-metoden 107

1. Valet av betingelser för kromatografisk bestämning av protamin i doseringsformerna av isofan-insulin 110

2. Studie av kromatografiska profiler av protaminer isolerade från olika fiskarter 121

3. Metod för bestämning av protamin i isofan-insulinpreparat 123

4. Validering av den utvecklade metoden 125

Allmänna slutsatser 136

Referenser 139

Allmänna egenskaper hos insulinets fysikalisk-kemiska och farmaceutiska egenskaper

Ur ett kemiskt perspektiv är insulin ett litet globalt protein med en molekylvikt på upp till 6000 Da. Samtidigt bör det noteras att insulin är ett vanligt namn för en hel familj av homologa proteiner av naturligt och artificiellt ursprung med en gemensam karakteristisk biologisk aktivitet. Proteinaturen hos insulin bildades 1928 [52]. Det är bland proteinerna som producerar biuretreaktionen och Pauli-reaktionen. Insulinstrukturen var helt etablerad i början av 50-talet. Den elementära kemiska sammansättningen av insuliner av olika ursprung karakteriseras av de siffror som anges i tabell 1 [40].

Aminosyrakomposition. De flesta insulinmolekylerna innehåller 51 aminosyrarester, varav 17 aminosyror finns i mest kända proteiner.

Ett karakteristiskt särdrag hos aminosyrasammansättningen av bovin, porcin och humant insulin är tryptofan och metionin. Aminosyrakompositionen av dessa typer av insulin presenteras i tabell 2 [40,46].

Invariant för alla typer av insulin är innehållet i cystin (6 halva cystinrester). Dessutom innehåller insulinmolekylen av alla typer 6 amidgrupper (asparagin, glutamin).

När insulin frisätts, tillsammans med huvudfraktionen kan fraktioner av deamiderad insulinform observeras. I den sura miljön, under deamidationsprocessen, kan alla 6 amidgrupper gradvis delas upp, och den elektroforetiska och kromatografiska rörligheten hos insulin förändras [40]. Bildandet av deamiderade former av insulin kan bedömas av resultaten av bestämningen av ammoniak. För fullständig amidform av insulin bestäms 6 mol ammoniak per 1 mol protein, för deamiderade former kan detta värde vara från 5 till 0.

Den primära strukturen av insulin. Den primära strukturen av insulin avkodades av Sanger-gruppen 1945-1955. Genom att använda ett antal kromatografiska metoder som gjorde det möjligt att separera och identifiera olika peptider, aminosyror och deras derivat, kunde Sanger etablera den primära strukturen hos bovint insulin [130 131 132 1333 134]. Vidare studier av insuliner av olika ursprung med användning av olika fysikalisk-kemiska metoder, inklusive Edman-metoden för bestämning av den fullständiga aminosyrasekvensen i långa peptider, bekräftade resultaten av Sanger och hans medförfattare på strukturen av insulin [bb].

Hittills har primärstrukturen för insulin bestämts av representanter för 24 arter som hör till 4 djurklasser: däggdjur, fåglar, fisk och cyklostomer [14]. Forskning på insulin av olika ursprung fortsätter [71,72,73].

Insulins struktur i olika djur är liknande men inte identisk. I sin primära struktur liknar humaninsulin svin, hund, spermhval och kaninsubuliner, som endast skiljer sig åt i en aminosyra [40]. Det skiljer sig från nötkreatinsinsulin med tre aminosyror. I större utsträckning liknar humaninsulin inte insulin från den guineanska grisen, fåglarna och fiskarna [40]. Skillnader i aminosyrasekvensen för humana, gris- och boskapsinsuliner visas i tabell 3.

Trots strukturella skillnader har alla typer av insuliner liknande biologisk aktivitet, d.v.s. orsaka hypoglykemisk effekt. Storleken på den visade biologiska aktiviteten beror dock starkt på arten och ligger inom intervallet 11 IE / mg (torskinsulin från Nordsjön) till 62 IE / mg (kalkon och kycklingsinsulin) medan aktiviteten av humant insulin är cirka 25-30 IE / mg [40]. Ju större skillnaderna mellan arterna är, desto större skillnad är den biologiska aktiviteten hos motsvarande insulin.

En funktionellt aktiv insulinmolekyl består av två polypeptidkedjor (A- och B-kedjor) bundna av disulfidbindningar; en bindning bildas av de sjunde aminosyraresterna i båda kedjorna, den andra disulfidbindningen bildas av den 20: e resten av A-kedjan och den 19: e resten av B-kedjan (Figur 2). Dessutom finns det ett tredje disulfidbindning i insulinmolekylen, som är intrachain och förbinder 6: e och 11: e A-kedjestånden [59,117].

Sekundär struktur Med hjälp av olika fysikalisk-kemiska och fysiska forskningsmetoder visades det att insulinmolekylen har en högbeställd rumslig struktur (konformation) som bidrar till genomförandet av specifika biologiska funktioner [14]. I molekylen av nativt insulin finns både cc-helix och p-vikta ark närvarande samtidigt. Dessutom finns områden med oordning struktur och struktur <3-петли. Участки, имеющие форму а-спирали, составляют 57 %, 6 % приходится на [3-складчатую структуру, 10 % построено в виде р-петли, оставшиеся 27 % не имеют упорядоченной структуры (рисунок 3) [25].

När en sur lösning av insulin (pH 2,3-2,5) upphettas vid en temperatur av +100 ° C och snabbt kyles till -80 ° C bildas så kallat fibrillärt insulin - en helt inaktiv form av hormonet [27]. Införandet av fibrillära insulinfibrer i en lösning av aktivt insulin orsakar spontan kvantitativ utfällning av insulin i form av fibriller [14,17].

Produktionsmetoder, standardisering och kvalitetskontroll av insulinpreparat

Erhålla djurinsulinart. Industriell produktion av nötkött och fläskinsulin etablerades nästan samtidigt i ett antal länder, strax efter upptäckten av insulin år 1921 [63]. Sedan dess har begreppet insamling av insulin förbli nästan oförändrat (tabell b) [17, 18]. Råvarorna för framställning av animaliska arter av insulin är bukspottkörteln hos slaktkreatur som används för mat.

Den viktigaste uppgiften vid framställning av insulin är dess rening - utsläpp av ämnen från besläktade föroreningar, vilket minskar den biologiska aktiviteten, orsakar immunologiska reaktioner eller är potentiellt farliga för patientens hälsa. Till exempel, efter flera års användning av dåligt renat insulin i patientens blod kan det finnas upp till 5000 IE insulin bunden till antikroppar. Antikroppar mot insulin påverkar signifikant profilen av dess aktivitet och bidrar därmed till den labila banan av diabetes.

Den första metoden för rening av insulin var omkristallisation i närvaro av zinksalter. År 1945 visades att den sjufaldiga omkristalliseringen av insulin signifikant minskar nivån av allergiska reaktioner hos patienter jämfört med de officiella insulinpreparaten vid den tiden [63].

Heterogeniteten av insulinprover efter kristallisering och enkel omkristallisation visas med hjälp av olika metoder: motströms extraktion (PE), fördelningskromatografi (PX), jonbyteskromatografi (IOC), diskelektrofores (DEP) och gelutsläppskromatografi (GEC) [63].

Det visade sig att de huvudsakliga samtidiga insulinföroreningarna är: proinsulin, dess intermediärer, kovalent insulindimer, monodisamidoinsulin, monoarginin och monoetylen, liksom ett antal högmolekylära föreningar av icke-insulin-natur. En generaliserad slutsats från resultaten av studierna, med beaktande av informationen om de upptäckta orenas immunförsvar [138], var slutsatsen om behovet av ytterligare rening av insulinämnen, så att man vid analys av DEF och GEC-metoder fann en komponent - motsvarande insulin.

För att lösa problemet med rening av insulin år 1950 föreslog HEC-metoden, och i 1970 anjonbytarkromatografi (AOX) -metod. Det visade sig att insulin, renat med AOX-metoden, innehåller cirka 500 ppm (delar per miljon) föroreningar med proinsulinaktivitet [137]. Ytterligare rening av insulin genom användning av högtrycksvätskekromatografi på omvända faser (RP HPLC) minskar innehållet av immunogena fraktioner till gränsen för deras detektion [63].

En översyn av den aktuella utvecklingen inom kromatografisk rening av insulin presenteras i [96]. Insulin, renad, sekventiellt, med användning av IOC och GEC, kallas monokomponentinsulin [63]. Få mänskligt insulin. Sökningen efter metoder för att erhålla humaninsulin berodde på två omständigheter. Å ena sidan, det brådska av råmaterialproblemet vid produktion av animaliskt insulin, å andra sidan, den snabba utvecklingen av vetenskapen på detta område gav en verklig möjlighet att få ideen till liv. 1979 och 1981 nästan samtidigt utvecklades två metoder för att erhålla mänskligt insulin - biosyntetisk och halvsyntetisk [102,108]. År 1981 började företaget Novo Nordisk för första gången i världen seriell produktion av human-halvsyntetisk insulin. Metoden som används av företaget är baserad på den enzymatiska och kemiska ersättningen av Al i porcin insulinmolekylen med återstoden av Tre [61]. Denna metod är direkt beroende av att erhålla den erforderliga mängden grisinsulin vilket minskar sitt ekonomiska värde. Möjligheten att erhålla humaninsulin genom biosyntetisk metod framkom med utvecklingen av rekombinant DNA-teknik [10]. Arbetet med genmodifierad insulinproduktion började för ungefär 25 år sedan. År 1978 rapporterades att en stam av E. coli-producerande råttaproinsolning erhölls. 1979 kunde Genentechs studier klona i E. coli generna som kodar för aminosyrasekvenser för. insulinkedjorna A och B inkluderade i p-halo-tacidasområdet i pBR322-plasmiden [10,102]. År 1981 syntetiserades en proinsulingenanalog av mini-C-proinsulin, i vilken 35-ledig C-peptid ersattes med ett segment av sex aminosyror: arg-arg-gly-ser-lys-arg och dess uttryck i E. coli visades. 1982 startade Eli Lilly världens första industriproduktion av humant insulin med hjälp av två kedjetekniker utvecklade i samarbete med Genentech [102]. För närvarande har möjligheten att erhålla humaninsulin med hjälp av olika expressionssystem visats [3,10,101,102]. Ur ekonomisk synvinkel är användningen av genetiskt modifierade stammar av gram-positiva E. coli-bakterier, av vilka många betraktas som överproducenter, av särskilt intresse [3]. Samtidigt uppnåddes signifikanta framsteg med Saccharomices cerevisiae-jästceller [3,75]. Tabell 7 visar de viktigaste, som är gemensamma för olika metoder för framställning av rekombinant humant insulin, stadierna av den tekniska processen [3,10,63].

Tillämpning av den utvecklade metoden för att testa officiella insulinpreparat

Högtrycksvätskekromatografi (HPLC) är en variant av kolonnvätskekromatografi, i vilken mobilfaseluenten - passerar genom sorbenten fyller kolonnen vid hög hastighet på grund av signifikant tryck (upp till 400x105 Pa) vid ingången till kolonnen [11].

Som ett sätt att analysera komplexa blandningar av ämnen såg HPLC för drygt 30 år sedan. Användningen av sorbenter med en partikeldiameter av 3-10 um orsakade en kraftig ökning av effektiviteten hos kromatografisk separation jämfört med den klassiska versionen av kolonnvätskekromatografi. Därför refereras HPLC ofta till högprestandavätskekromatografi (HPLC). Instrumentella egenskaper vid användningen av HPLC beskrivs i detalj i många handböcker [49.50] och i relevanta avsnitt i den ledande farmakopén [79,150]. För HPLC har ett brett spektrum av sorbenter utvecklats och producerats. Enligt författarna till undersökningen [51] producerar cirka 100 företag över hela världen mer än 300 typer av sorbentnamn. Historien, nuvarande tillstånd och utsikterna för metodens utveckling diskuteras i recensioner [51] och [77.78].

I sina olika varianter används HPLC-metoden i stor utsträckning vid farmaceutisk analys (produktionskontroll och testning av läkemedelskvalitet). Metoden ingår i alla ledande farmakopéer i världen. Denna metod beskrivs mest fullständigt i de europeiska och amerikanska farmakopéerna. HPLC används för att identifiera droger för bestämning av renhetsgrad, molekylviktsfraktionskomposition och kvantitativ analys. I US Pharmacopoeia 28 ed. cirka 30% av privata artiklar involverar användning av HPLC. I European Pharmacopoeia 4th ed. denna siffra är ca 40%.

Den första kromatografiska metoden för insulintestning var lågtrycksgelutsläppsvätskekromatografi (GE ZhND). Principen för separation under betingelserna för HPLC är baserad på molekylerna av olika storlekar med olika förmåga att penetrera i porerna i den neutrala gelén, vilken tjänar som en stationär fas. Den hydrodynamiska diametern hos insulinmonomeren och dimeren är proportionell mot deras molekylvikt och är 2,69 respektive 5,50 nm [115].

I 1967 visade man att GE-IHDD-metoden visade att kommersiella beredningar av insulin, renade genom kristallisation, innehåller föroreningar med en molekylvikt som överstiger insulinmolekylvikten [63]. På kromatogrammen av svinsinsulin hittades tre toppar, konventionellt betecknade som a-, b- och c-komponenter. Sedan dess har ett antal kromatografiska system föreslagits för att kontrollera innehållet av urenheter med hög molekylvikt i insulinpreparat. Separationen utfördes på höghöjande agaros-xerogeler (Bio-Gel P-30, Bio-Rad Lab.) Eller dextran (Sephadex G-50, Pharmacia Fine Chemicals), 1-3 M lösningar av ättiksyra användes som IF [127]. Höga känslighet för dessa sorbenter för kompression vid tryck som överskrider matrissvullningstrycket gör dessa material olämpliga för användning i HPLC-läget.

Användningen av geluteslutningsvätskekromatografi vid höga tryck (GE HPLC) för insulinanalys beskrives först 1980, efter utvecklingen av hårda makroporösa sorbenter kompatibla med vatten och motstå höga tryck. I [151] utfördes separationen på kolonner Protein-Pak 1-125 (Waters), TSK-Gel SW 2000 (Toho Soda Corp.), Bondagel (Pharmacia) under denatureringsbetingelser (kombination av 7 M lösning av urea, mineralsyror och icke-joniska detergenter). Behovet av insulinanalys under denatureringsbetingelser är associerat med insulinens förmåga att aggregera i lösning. För separation av insulin under betingelserna för HPLC HPLC har användningen av den "traditionella" elueringsättiksyra också beskrivits [152]. Användningen av ättiksyra har flera fördelar - minimal påverkan på de separerade föreningarnas inbyggda struktur, tillgänglighet, låg kostnad, dessutom är ett viktigt faktum att ättiksyra kan undertrycka sammansättningen av insulin.

För närvarande är HPLC ghvd en farmakopéiell metod för att övervaka innehållet av föroreningar med hög molekylvikt i substanser och färdiga doseringsformer. Metoden används också för att bestämma innehållet av protamin i isofan-insulinpreparat.

Användningen av HPLC på reverserade faser (RP HPLC) för separering av nötkreatur och svampinsulin för första gången demonstrerade den höga effektiviteten hos denna metod för analys av insulinliknande peptider med en liknande struktur.

Mekanismen för separation av proteiner och polypeptider under betingelserna för RP HPLC är baserad på olika hydrofobicitet hos insulinmolekyler och besläktade föroreningar. Hittills har flera dussintals metoder för kromatografisk separation av insulin av olika ursprung och deras derivat, innefattande proinsulin, pankreatiska polypeptider, dezamido-derivat, insulindimer, beskrivits. [126] visade möjligheten att separera kyckling, kanin, får och hästinsulin. Människo-, nötkött- och fläskinsulin separerades också. Lloyd och Corran publicerade en metod för att separera nötkött, fläsk, humana insuliner och deras motsvarande deamiderade former [104].

Separering utförs på silikagel-sorbenter modifierade, metyl-, butyl-, oktyl-, oktadecyl- och fenylgrupper i isokratiskt eller gradientläge. Som PF används organiska modifieringsmedel - acetonitril, metylalkohol, isopropylalkohol, blandad med vattenhaltiga buffertlösningar innehållande oorganiska salter och jon-ångreagenser. Toppdetektering utförs huvudsakligen genom spektrofotometrisk metod vid en våglängd av 190-220 nm, fluorimetriska metoder beskrivs också [103].

Analysen av substansen och de färdiga doseringsformerna av insulin med användning av RP HPLC beskrivs i privata artiklar i den amerikanska och europeiska farmakopén [79,150]. Metoden används för att testa droger i den angivna gruppen vad gäller "Insulin Authenticity", "Related Proteins", "Quantitative Determination" och "Insulin in Solution".

Forsknings litteraturen beskriver också användningen av jonbyte och affinitetskromatografi för insulinanalys [44.102], men dessa metoder har emellertid inte använts i stor utsträckning i farmakopépraxis.

Valet av betingelser för kromatografisk bestämning av protamin i doseringsformerna av isofan-insulin

En ökning av PF-jonstyrkan leder vanligtvis till en ökning av insulinkapacitetsförhållandena, vilket kan orsakas av ett antal faktorer: - ökning av jonkoncentrationen minskar graden av jonisering av de laddade grupperna i proteinmolekylen, ökar dess hydrofobicitet / - hög koncentration av katjoner bidrar till att screena fria silanolgrupper på ytan en fas som försvagar den icke-specifika elektrostatiska interaktionen av de protonerade aminogrupperna i proteinet med matrisen; - Hög jonstyrka påverkar den rumsliga strukturen hos insulin, vilket medför att ytan som är tillgänglig för interaktionen med sorbenten förändras. Koncentrationen av oorganiska salter i FS påverkar formen av topparna och selektiviteten hos separationen av insulin och desamido-Asn-insulin [143,144]. Med isokratisk eluering på LiChrosorb Сів sorbent med 0,1 M natriumfosfatlösning (pH 2,3) uppnåddes ett tillfredsställande resultat endast när natriumsulfat tillsattes till buffertlösningen till en koncentration av 0,1 M. De flesta insulinanalysmetoder som ingår i farmakopéartiklarna och ND, använd PF på basis av buffertlösningar med en natriumsulfathalt som är lika med 0,2 M. Ett sådant högt innehåll av natriumsulfat påverkar negativt reproducerbarheten av kromatografiska resultat på grund av stratification av eluenter, Högkoncentrerade saltlösningar har en negativ effekt på kromatografisk utrustning, förkortar dess livslängd. Med tanke på att farmakopéanalysmetoderna utvecklades för mer än 20 år sedan, verkade det intressant att studera det kromatografiska beteendet hos insulin under OF-HPLC på de senaste generations kromatografiska sorbenterna, beroende på koncentrationen av natriumsulfat. Samtidigt försökte de ta reda på om en minskning av natriumsulfatinnehållet i PF är tillåtet utan en signifikant försämring av kromatografisystemets separationsförmåga. Som ett resultat av forskningen visade sig effekten av natriumsulfatkoncentration i PF, beroende på typen av ympad fas, liksom på typen av insulin. På sorbenter med ympade grupper C4 och C selektiviteten av separationen av toppar av humant insulin och desamido-Asn-humant insulin beror inte på natriumsulfatkoncentrationen i. bufernom1 lösningen inom området från 0,05 M till 0,2 M. I sorbent Diasfer-110-C18 selektiviteten för separation av ett givet par av toppar har ett maximum vid 0,05 M och minst 0,1 M (fig 4). Å andra sidan, är selektiviteten för separation av insulin och djurarter motsvarande deamiderade former av AsnA21 inte beroende av jonstyrkan hos lösningen på separations sorbenten Diasfer-110-C18. På en sorbent med C8-ympade grupper ökar selektiviteten från 1,25 till 1,28 med en ökning av natriumsulfatkoncentrationen (figur 4). På sorberande ympade grupper C4 separations selektivitet i fallet med nötinsulin maximal när 0,1 M natriumsulfat och minimal vid 0,2 M. För svininsulin har detekterats en uttalat maximum vid 0,1 M natriumsulfat koncentration, i detta fall ökande jonisk krafterna ledde till en minskning av separativ selektivitet (figur 4). Antalet effektiva teoretiska plattor ökar med ökande natriumsulfatkoncentration. Undantaget är beteendet av humant insulin på sorbenten Diasfer-110-C8 (figur 5). Graden av separation av topparna och desamido-insulin Asn -insulin ökar med ökande jonstyrka FS självständigt på växtarter och typ av insulin ympad fas (diagram b). Genom att reducera koncentrationen av natriumsulfat från 0,2 M till 0,1 M separationsgrad valt par av toppar reduceras med i genomsnitt 5% - för människa och svin insuliner, och 10% - för nötkött insulin. Med tanke på att det absoluta värdet för graden av separation överstiger 2,0, försämring av den uppmätta separationskolonnen kapacitet, enligt vår mening, är det inte nödvändigt. Följaktligen kan koncentrationen av natriumsulfat i buffertlösningen PF minskas med 2 gånger i jämförelse med farmakopoiala analysmetoder.

I de flesta studier på analys av proteiner och peptider utföres separationen vid rumstemperatur. Dessutom indikerar vissa författare att effekten av temperaturen på separativ selektivitet är minimal [48]. När temperaturen ökar accelereras emellertid processen med massutbyte mellan de stationära och mobila faserna, vilket leder till en minskning av peptidens retentionstid och en minskning av topparna.

Insulinteknik

Brott mot insulinsekretion. Användningen av affilierad fotografi. Schema för insulin. Uttryck av proinsulin i E. coli-celler. Tillvägagångssätt för att lösa problemet med diabetes. Bidraget från bioteknik till industriell produktion av icke-peptidhormoner.

Skicka ditt bra arbete i kunskapsbasen är enkelt. Använd formuläret nedan.

Studenter, doktorander, unga forskare som använder kunskapsbasen i sina studier och arbeten kommer att vara mycket tacksamma för dig.

Publicerad den http://www.allbest.ru/

MINISTERI FÖR UTBILDNING OCH VETENSKAP FÖR REPUBLIKEN KAZAKSTAN

KAZAKH AGRO-TEKNISK UNIVERSITET NAMAD EFTER S.SEYFULLIN

Institutionen för mikrobiologi och bioteknik

På ämnet "Bioteknik mokroorganizmov"

På ämnet: Teknik för insulin

Avslutat: Myrzabek M? Ldir Kurbanbek? Yzy

Kontrollerad: Akimbaeva A.K. (k. B. N.)

FÖRKORTELSER OCH SYMBOLER

1. Historia av upptäckten

2. Få insulin i bioteknik

3. sätt att få humant insulin

4. Uttryck av proinsulin i E. coli-celler

5. Rening av insulin

6. Dosering och administrering

I denna kurs användes följande definitioner:

Proteinbärare - tillhandahållande av transport av hybridproteinet i det periplasmatiska utrymmet hos cellen eller odlingsmediet;

Affinitetskomponent - underlättar väsentligt valet av ett hybridprotein.

Insulin (från latinska Insula-ön) är ett peptidhormon som bildas i betacellerna i Langerhans pankreatiska öar.

Interleukiner är en grupp av cytokiner som syntetiseras huvudsakligen av leukocyter (av denna anledning valdes slut-"-leukin").

Proinsulin är en föregångare av insulin syntetiserat av B-cellerna i bukspottkörtelns insulinapparat.

Kromatografi (från grekiska. Chroma, kromatosfärg, färg), fysikalisk-kemisk metod för separation och analys av blandningar, baserat på fördelningen av deras komponenter mellan de två faserna - stationär och mobil (elueringsmedel), som strömmar genom det stationära.

Encapsulation - en programmeringsspråksmekanism som begränsar åtkomst till komponenter som utgör ett objekt (metoder och egenskaper), gör dem privata, det vill säga endast tillgängliga inom ett objekt.

Ett fusionsprotein (fusionsprotein, även ett chimärförenat protein) är ett protein erhållet genom att kombinera två eller flera gener som ursprungligen kodade separata proteiner.

Hormoner, biologiskt aktiva substanser som produceras av endokrina körtlar eller endokrina körtlar och utsöndras direkt av dem i blodet.

Diabetes mellitus är en grupp av endokrina sjukdomar, som utvecklas till följd av absolut eller relativ insufficiens av hormoninsulin.

Somatostatin är ett hormon av deltacellerna i pankreasöarna av Langerhans, liksom ett av hormonerna i hypotalamusen.

Radioimmunanalys är en metod för kvantitativ bestämning av biologiskt aktiva substanser (hormoner, enzymer, droger etc.) i biologiska vätskor, baserat på den konkurrenskraftiga bindningen av det önskade stabila och liknar dem radionuklidmärkta substanser med specifika bindningssystem.

FÖRKORTELSER OCH SYMBOLER

HPLC - Vätskekromatografi med hög prestanda

cDNA - komplementär deoxiribonukleinsyra

Insulinens huvudsakliga funktion är att säkerställa permeabiliteten hos cellemembran för glukosmolekyler. I en förenklad form kan man säga att inte bara kolhydrater, men också några näringsämnen i slutändan delas upp i glukos, som används för att syntetisera andra kolhaltiga molekyler, och är den enda typen av bränsle för cellulära kraftverk - mitokondrier. Utan insulin sjunker permeabiliteten hos cellmembranet till glukos 20 gånger, och cellerna dör av svält och det överskott av socker som upplöses i blodet förgiftar kroppen.

Insulinsekretionsnedbrytning på grund av beta-cellförstöring - absolut insulinbrist - är ett nyckelelement i patogenesen av typ 1 diabetes mellitus. Brott mot effekten av insulin på vävnad - relativ insulinbrist - har en viktig plats vid utvecklingen av typ 2-diabetes.

Användningen av affinitetskromatografi har signifikant reducerat innehållet av förorenande proteiner i preparatet med en högre molekylvikt än insulin. Sådana proteiner innefattar proinsulin och partiellt klyvda proinsuliner, vilka kan inducera framställning av antiinsulinantikroppar.

Användningen av humaninsulin från början av behandlingen minimerar förekomsten av allergiska reaktioner. Humant insulin absorberas snabbare och, oavsett form av läkemedlet, har en kortare verkningsaktivitet än animaliskt insulin. Mänskliga insuliner är mindre immunogener än fläsk, särskilt blandade bovina och svampinsuliner.

Syftet med kursen är att studera insulintekniken. För att uppnå följande mål fastställdes:

1. få insulin i bioteknik

2. sätt att få insulin

H. Insulinrening

Insulins upptäckts historia är associerad med namnet på den ryska läkaren I.M. Sobolev (andra hälften av 1800-talet), som visade att nivån på socker i humant blod regleras av ett speciellt hormon i bukspottkörteln.

År 1922 introducerades insulin som isolerats från bukspottkörteln hos en djur för första gången till en tioårig pojke. En diabetespatienter överträffade alla förväntningar och ett år senare släppte det amerikanska företaget Eli Lilly den första animaliska insulinberedningen.

Efter att ha fått den första industriella satsen av insulin de närmaste åren har ett enormt sätt att isolera och rensa blivit täckt. Som ett resultat blev hormonet tillgängligt för patienter med typ 1-diabetes.

År 1935 optimerade danska forskaren Hagedorn insulininsatsen i kroppen genom att föreslå en långvarig medicinering.

De första insulinkristallerna erhölls 1952, och 1954 avkodade den engelska biokemisten G. Senger deformationen av insulin. Utvecklingen av metoder för rening av hormonet från andra hormonella substanser och produkter med insulinnedbrytning gjorde det möjligt att erhålla homogent insulin, kallat single-component insulin.

I början av 70-talet. Sovjetforskare A. Yudaev och S. Shvachkin föreslog kemisk syntes av insulin, men genomförandet av denna syntes i industriell skala var dyr och olönsam.

I framtiden var det en gradvis förbättring av renhetsgraden av insuliner, vilket minskade problemen som orsakades av insulinallergier, nedsatt njurfunktion, synnedgång och immuninsulinresistens. Det mest effektiva hormonet behövdes för substitutionsbehandling i diabetes mellitus - homologt insulin, det vill säga humant insulin.

På 80-talet gjorde framsteg inom molekylärbiologi det möjligt att syntetisera båda humana insulinkedjor med användning av E. coli, vilka sedan kombinerades till en biologiskt aktiv hormonmolekyl, och rekombinant insulin erhölls med användning av genetiskt manipulerade E. coli-stammar vid Institute of Bioorganic Chemistry.

2. Få insulin i bioteknik

Insulin, ett peptidhormon av pankreatiska öarna i Langerhans, är den huvudsakliga behandlingen för diabetes mellitus. Denna sjukdom orsakas av insulinbrist och manifesteras av en ökning av blodglukosnivåerna. Hittills har insulin erhållits från bukspottkörteln hos en tjur och en gris. Läkemedlet skilde sig från humant insulin 1-3 aminosyrautbyten, så att det var ett hot om allergiska reaktioner, särskilt hos barn. Storskalig terapeutisk användning av insulin begränsades av höga kostnader och begränsade resurser. Genom kemisk modifiering gjordes insulin från djur oskiljbart från människa, men detta innebar en ytterligare ökning av kostnaden för produkten. [1]

Sedan 1982 har Eli Lilly producerat genetiskt konstruerat insulin baserat på separat syntes av E. colie- och B-kedjor. Kostnaden för produkten har minskat betydligt, det producerade insulinet är identiskt med människa. Sedan 1980 har det förekommit rapporter i pressen om kloning av proinsulingenen, en prekursor av hormonet, som passerar in i en mogen form med begränsad proteolys.

Inkapslingstekniken är också kopplad till behandling av diabetes: pankreasceller i en kapsel, som introduceras en gång i patientens kropp, producerar insulin inom ett år.

Integrerad genetik har lanserat produktionen av follikelstimulerande och luteiniserande hormoner. Dessa peptider är sammansatta av två subenheter. På agendan är frågan om industriell syntes av oligopeptidhormoner i nervsystemet, ankefaliner, byggda från 5 aminosyrarester och endorfiner, morfinanaloger. Med rationell användning av dessa peptider lindrar smärta, skapa bra humör, öka effektivitet, koncentrera uppmärksamhet, förbättra minne, sätta i ordning sömnen och vakenheten. Ett exempel på den framgångsrika tillämpningen av gentekniska metoder är syntesen av p-endorfin med användning av hybridproteinteknologin som beskrivits ovan för ett annat peptidhormon, somatostatin [2].

3. sätt att få humant insulin

Historiskt sett är det första sättet att erhålla insulin för terapeutiska ändamål att isolera analoger från detta hormon från naturliga källor (bukspottkörtelöar hos nötkreatur och svin). Under 20-talet av det senaste århundradet konstaterades att bovin och svinsinsulin (som är närmast humaninsulin i struktur och aminosyrasekvens) visar aktivitet i människokroppen som är jämförbar med humant insulin. Därefter användes bovint eller svinsinsulin under lång tid för att behandla patienter med typ 1-diabetes. Efter en tid visades det emellertid att antikroppar mot nötkreatur och svamp insuliner i vissa fall börjar ackumulera i människokroppen och därigenom upphäva effekterna.

Å andra sidan är en av fördelarna med denna metod för att erhålla insulin tillgången på råmaterial (nötkreatur och svinsulin kan enkelt erhållas i stora mängder) som spelade en avgörande roll vid utvecklingen av den första metoden för erhållande av humant insulin. Denna metod kallas halvsyntetisk [3].

I denna metod för framställning av humant insulin användes svinsulin som ett råmaterial. Renat svininsulin spjälkades av B-kedjans C-terminala oktapeptid, varefter den C-terminala oktapeptiden av humant insulin syntetiserades. Därefter var det kemiskt fastsatt, de skyddande grupperna avlägsnades och det erhållna insulinet renades. Vid testning av denna metod för erhållande av insulin visades den fullständiga identiteten av hormonet som erhölls för humant insulin. Den största nackdelen med denna metod är den höga kostnaden för det resulterande insulinet (även nu är den kemiska syntesen av oktapeptid dyr, speciellt i industriell skala).

För närvarande erhålls humant insulin huvudsakligen på två sätt: genom att modifiera fläskinsulin genom en syntetisk-enzymatisk metod och genom en genteknikmetod.

I det första fallet är metoden baserad på det faktum att svinsinsulin skiljer sig från humant insulin genom en enda substitution vid C-änden av Ala30Thr B-kedjan. Alanin till treonin substitution utförs genom enzymkatalyserad klyvning och sammanfogning alanin i stället för skyddad karboxylgrupp treoninrest närvarande i reaktionsblandningen i ett stort överskott. Efter klyvning av den skyddande O-tert-butylgruppen erhålles humant insulin. (bild 1)

Figur 1 - Diagram över metoder för framställning av humant insulin

Insulin var det första proteinet som erhölls för kommersiella ändamål med användning av rekombinant DNA-teknik. Det finns två huvudsakliga metoder för att erhålla genetiskt manipulerat humant insulin. I det första fallet producerar separata (olika producentstammar) båda kedjorna följt av vikningen av molekylen (bildandet av disulfidbroar) och separationen av misoformen. I det andra preparatet i form av en prekursor (proinsulin) följt av enzymatisk klyvning med trypsin och karboxipeptidas. In till den aktiva formen av hormonet. Mest föredragna för närvarande är att tillhandahålla insulin som prekursor som tillhandahåller den korrekta stängningen av disulfidbryggorna (i fallet av separata mottagningskedjor transporteras, successiva cykler av denaturering, renaturering och mizoform separation [3].

I båda tillvägagångssätt är det möjligt både individuellt att erhålla startkomponenterna (A- och B-kedjor eller proinsulin) och som en del av hybridproteiner. Förutom A- och B-kedjor eller proinsulin kan det finnas närvarande i kompositionen av hybridproteiner:

1) bärarprotein - säkerställande av transporten av hybridproteinet i det periplasmiska utrymmet hos cellen eller odlingsmediet;

2) affinitetskomponent - underlättar väsentligt valet av ett hybridprotein.

Samtidigt kan båda dessa komponenter vara närvarande samtidigt i hybridproteinets sammansättning. Dessutom, när man skapar hybridproteiner kan användas multimert princip (dvs i hybridproteinet är närvarande multipla kopior av mål-polypeptid) kan avsevärt öka utbytet av önskad produkt [4].

Vi använde en stam JM 109 N1864 med integrerat i en plasmid en nukleotidsekvens som uttrycker ett fusionsprotein som består av en linjär proinsulin och fäst vid sin N-ände via en metioninrest AStaphylococcusaureus proteinfragment. Odling av den mättade biomassen av celler i den rekombinanta stammen säkerställer starten av produktionen av hybridproteinet, varvid isoleringen och sekventiell omvandling av vilken intube leder till insulin. En annan grupp av forskare mottog i bakterieuttryckssystemet ett fusionsrekombinant protein bestående av humant proinsulin och en polyhistidin-svans ansluten till den via en metioninrest. Den isolerades med användning av kelatkromatografi på Ni-agaroskolonner från inklusionskroppar och spjälkades med cyanogenbromid. Författarna bestämde att det isolerade proteinet är S-sulfuriserat. Kartläggning och massanalys av den resulterande proinsulin renas genom jonbyteskromatografi på anjonbytaren och RP (omvänd fas) HPLC (högupplösande vätskekromatografi) spektrometrisk visade närvaron av disulfidbryggor, motsvarande disulfidbryggorna i nativt humant proinsulin. Det rapporterade också om utvecklingen av en ny, förbättrad metod för att erhålla humaninsulin genom genetiska metoder i prokaryota celler. Författarna fann att det erhållna insulinet i sin struktur och den biologiska aktiviteten är identisk med det hormon som isolerats från bukspottkörteln [5].

Nyligen har noggrannhet gjorts för att förenkla förfarandet för att producera rekombinant insulin genom gentekniska metoder. Således erhölls ett fusionsprotein bestående av en interleukinledande peptid bunden till N-terminalen av proinsulin via en lysinrest. Proteinet uttrycks effektivt och lokaliseras i inklusionskroppar. Efter isolering spjälkades proteinet med trypsin för framställning av insulin och C-peptid. En annan grupp forskare agerade på liknande sätt. Fusionsproteinet bestående av proinsulin och två syntetiska domäner av Staphylococcus protein A, som binder IgG, lokaliserades i inklusionskroppar men hade en högre expressionsnivå. Proteinet isolerades genom affinitetskromatografi med användning av IgG och behandlades med trypsin och karboxipeptidas B. Det resulterande insulinet och C-peptiden renades genom RP-HPLC. När man skapar fusionsstrukturer är massförhållandet mellan bärarproteinet och målpolypeptiden väldigt signifikant. Således beskrivs utformningen av fusionskonstruktioner, där ett protein som binder humant serumalbumin användes som bärarpolypeptid. En, tre och sju C-peptider fästes på den. C-peptid var anslutna på en "head-tail" med aminosyradistansorganen som bär restriktionsställen Sfil och två argininrest vid början och vid slutet av ett distansorgan för den efterföljande trypsin digestion av proteinet. HPLC-klyvningsprodukter visade att C-peptid klyvdes kvantitativt och detta medger användning av metoden för multimera syntetiska gener för att producera målpolypeptider i industriell skala.

Erhålla mutant proinsulin, vilket innehöll ersättningen av Arg32Tyr. Med den gemensamma klyvningen av detta protein med trypsin och karboxipeptidas B bildades nativt insulin och C-peptid innehållande en tyrosinrest. Den senare, efter 125I-märkning, användes aktivt i radioimmunoanalys [6].

Insulinkvalitetskontroll

Innehållet

1. Allmän information om hur man får insulin 5

2. Metoder som används för att kontrollera insulinets kvalitet 8

Referenser 17

Utdrag ur arbetet

1-2% av den europeiska befolkningen lider av diabetes och cirka 20% av dessa patienter kan inte existera utan insulininjektioner. Sedan de första försöken om användning av insulin för behandling av diabetes år 1922 isolerades detta hormon från bukspottkörteln hos djur (kor och grisar). Animalisk insulin är något annorlunda i aminosyrasekvensen från humant insulin.

Människo- och grisinsuliner är särskilt nära: i grisinsulin ersätts den C-terminala treoninen i B-kedjan med alanin. Koe och humant insulin skiljer sig åt i tre aminosyrarester. Det var dessa skillnader som bestämde den ökade immunogena aktiviteten hos bovint insulin i jämförelse med grisinsulin.

Nästan alla patienter som behandlades med koinsulin hade antikroppar mot insulin i blodet. De antigena egenskaperna hos insulin bestämdes också partiellt av föroreningar i dess preparat. Mest sannolikt var det bildandet av antikroppar mot insulin som förklarade några mindre biverkningar när man injicerade koinsulin, till exempel atrofi av subkutant fett på återinjektionsstället. För högrenat insulin var dessa effekter frånvarande.

Därefter, tack vare genteknik och användning av E. Coli, erhölls humant insulin.

Humant insulin, erhållet av E. coli, var det första "genetiskt manipulerade" proteinet som testades hos människor. I försök med friska frivilliga har det visat sig att det är säkert (orsakar inte allergiska och andra oönskade reaktioner) och har förmåga att sänka glukosnivån i blodet när det administreras under huden eller intravenöst.

För närvarande erhålls sådant humant insulin av många diabetiker världen över. Detta föregicks av kliniska prövningar där metaboliska förändringar och immunologiska effekter studerades.

Relevansen av vårt ämne är att okontrollerad eller dålig kontrollerad produktion kan leda till utsläpp av förorenade insulinpreparat, vilket i sin tur kan leda till negativa kliniska konsekvenser.

Syftet med detta arbete är att studera de metoder som används vid kvalitetskontroll av insulin.

referenser

GOST R 52249-2004 "Regler för produktion och kvalitetskontroll av läkemedel" 2004

OFS 42-0002-00 "Bakteriella endotoxiner" 2000

OFS 42-0126-09 "Biologisk testning av insulin"

Ryska federationens farmakopéartikel FS 42-2620-97. 1997

Bairamashvili D.I. Geneteknik av humaninsulin: framgångar och utsikter // Rysk kemisk tidskrift. - 2005. - T. XLIX. - № 1 - s. 34-45.

Goncharenko G.G. Grundläggande bioteknik: Undervisningsmetod. komplex för stud.biolog. spec. / G.G. Goncharenko, A.V. Kruk, E.M. Stepanova, A.A. Surkov, S.A. Zyatkov; Min. arr. RB. - Gomel: EI "GGU im.F. Skaryna, 2008. - 282 sid.

Ryabko, Yu.S., Lukin, OV, Shepel, E.N. Tillämpning av den kinetisk-kromogena metoden för bestämning av bakteriellt endotoxin (LAL-test) i reningen av genetiskt manipulerat humant insulin // Biopharmaceutical journal - 2009. - Vol. 1. - №1. - s. 34-37.