Bestämning av glukos med glukosoxidasmetoden

Analyser

Att bestämma glukoskoncentrationen i blodet är en av de vanligaste biokemiska studierna i laboratorier.

Glukosoxidasmetoden för bestämning av glukos i blodet och urinen är baserat på reaktionen av glukosoxidation i närvaro av enzymet glukosoxidas med bildandet av väteperoxid, vilket i sin tur i närvaro av peroxidas oxiderar ortotolidin för att bilda färgade produkter; o Koncentrationen av glukos är lovad av mängden färgade produkter.

Eftersom glukosoxidasmetoden syftar till att identifiera glukos, och inte alla typer av sockerarter, används den i differentialdiagnosen av följande sjukdomar:

Principen för glukosoxidasmetoden för bestämning av glukos

Glukos i närvaro av enzymet glukosoxidas oxideras genom atmosfäriskt syre för att bilda väteperoxid under reaktionen. Väteperoxid i närvaro av peroxidasenzym oxiderar ortotoluidin för att bilda en färgad förening, vars färgintensitet är proportionell mot glukosinnehållet. Med denna metod kan du bestämma nivån av glukos i blodplasma, serum och cerebrospinalvätska.

Normal blodglukos, mmol / l

- i plasma, i natsheart

nyfödda - 1,7 - 4,2
barn från 6 veckor till 15 år - 3,3 - 5,4
vuxna (män, kvinnor) - 3,9 - 5,6

- i serum, hos natsheart

nyfödda - 2,6 - 4,2
barn från 6 veckor till 2 år - 3,3 - 5,4
vuxna (män, kvinnor) - 3,9 - 5,6

Nödvändiga reagens för glukosbestämning med glukosoxidasmetoden

1. Natriumklorid 9 gram / liter (isotonisk lösning): framställd genom upplösning av 0,9 g NaCl i 100 ml vatten.

2. Zinksulfat, 50 g / l: 5 g zinksulfat (ZnSO4) löses i vatten, volymen bringas till 100 ml.

3. Natriumhydroxid, 0,3 mol / l: beredd genom att lösa 1,2 g NaOH i 100 ml vatten, koncentrationen kontrolleras genom titrering (den ska vara 0,3 n).

4. Ortotoluidin, 1% lösning: 1 g av läkemedlet löses i 100 ml absolut alkohol. Lösningen kan förvaras i kylskåp i en flaska med ett glaspropp i flera månader. En kommersiellt tillgänglig produkt kan renas genom omkristallisation, för vilken den löses i absolut alkohol, vatten tillsättes och de utfällda kristallerna sugs på ett filter och torkas sedan över kalciumklorid.

5. Acetatbuffertlösning pH 4,8: Blanda 4 delar 0,25 n ättiksyra (kontroll genom titrering) och 6 delar 0,25 n natriumacetat (innehåller 34 g CH3COONa X ЗН2О i 1 liter).

6. Glukosoxidas är ett torrt preparat med en aktivitet av 3000 enheter / mg eller mer.

7. Pepparrotperoxidas. 1 mg löses i 5 ml acetatbuffert, den kan förvaras i kylskåp i flera dagar.

8. Arbetsreagens: Lös upp 2 mg glukosoxidas och 1 mg peroxidas i 80 ml acetatbuffert, tillsätt 1 ml 1% ortotoluidinlösning, blanda och häll volymen till 100 ml med buffertlösning. Arbetsreagenset måste vara transparent, färglöst eller ha en svag grön nyans, i vilket fall den är stabil vid förvaring i kallt tillstånd. Om färgen är intensiv eller efter några timmar efter beredningen börjar en fällning falla, betyder det att ortopoluidin inte är tillräckligt ren och behöver omkristalliseras.

9. Kalibrera glukoslösningar. Glukos förtorkas vid 37 ° C och lagras i en torkmedel. Förbered först en baslösning med en koncentration på 50 mmol / l, för vilken 180 mg av ämnet är upplöst i 20 ml av en mättad lösning (ca 0,3%) bensoesyra. Utifrån denna lösning, förbereda arbetskalibreringslösningar innehållande 3; 6; 9; 12; 15; 18 och 21 mmol / l, för vilka de tar 0,6; 1,2; 1,8; 2,4; 3; 3,6 och 4,2 ml av baslösningen och bringa den mättade lösningen av bensoesyra till en volym av 10 ml. Dessa lösningar innehåller glukos i samma koncentrationer som det förekommer i blodet, vilket underlättar beräkningar under kalibreringen.

Framsteg av glukosbestämning med glukosoxidasmetoden

I centrifugrören tillsättes 1,1 ml natriumkloridlösning, 0,4 ml zinksulfatlösning och 0,4 ml 0,3 n NaOH-lösning, blandas; samtidigt bildas en mycket tunn zinkhydroxidgel, 0,1 ml blod eller kalibreringslösning släpps in i den, blandas igen och centrifugeras efter 10 minuter med en hastighet av 3000 rpm i 10 minuter.

Till 1 ml supernatant tillsätt 3 ml arbetsreagens och blanda försiktigt.

En färg börjar gradvis utvecklas, som vid normala rumstemperaturer når maximalt på 13-15 minuter och sedan gradvis minskar. Fotometrisk alltid efter samma tidsperiod efter tillsats av arbetsreagens i kyvetter med en optisk väglängd på 1 centimeter med ett rött ljusfilter (våglängd 625 nm) mot tomgångsupplevelse, som ställs in samtidigt med arbetsproverna, men istället för blod, tar fysiologisk natriumkloridlösning.

Vid beredning av kalibreringsgrafen tas 0,1 ml av lämplig kalibreringslösning i stället för blodprover.

Beräkning av glukos kan utföras enligt proportionsregeln eller kalibreringsschemat, för att bygga som glukoskoncentrationen (mmol / l) läggs på en axel och utrotningsvärdet är å andra sidan.

Anmärkningar om metoden för glukosbestämning med glukosoxidasmetoden

1. Du kan först släppa blodet från pipetten i en isotonisk lösning av natriumklorid och sedan tillsätta lösningar av zinksulfat och NaOH.

2. Med systematiskt arbete är det inte nödvändigt att ständigt bygga ett kalibreringsschema för alla punkter. Det är tillräckligt att bearbeta ett blankt prov och 2-3 punkter i intervallet 3-9 mmol / l dagligen och bygga endast ett fullständigt kalibreringsschema vid byte av reagens eller justering av proceduren.

Glukosoxidasmetod för bestämning av glukos

Glukosoxidasmetoden används för att bestämma koncentrationen av glukos uteslutande i olika kroppsvätskor. Fördelen med detta test är dess noggrannhet. Diagnostik, i motsats till snabba metoder, tillåter att avslöja mängden ren glukos utan fruktos och andra sockerarter. Principen för denna reaktion är att färga lösningen, vilken uppstår som ett resultat av interaktionen mellan oxidationsmedel och specifika färgämnen. Utvärdering av forskningsresultaten utförs med hjälp av metoden för kolorimetri och jämförelse med standardlösningar.

När föreskrivs glukosoxidasmetoden?

Detta test används för att detektera nedsatt sockertolerans och utvecklingen av före diabetes, liksom på sjukdomshöjden. Men analys används sällan för sådana ändamål, det beror på höga kostnader och långa väntan på resultatet. Oftast används bestämningen av glukos i blodet och urinen med hjälp av denna metod vid differentialdiagnosen av sjukdomar som:

laktosintolerans syndrom;
fruktosintolerans;
frisättningen av fruktos med kroppsvätskor;
ökad koncentration av pentos i urinen.

Den obestridliga fördelen med glukosoxidas test är dess noggrannhet.

Vilken är grunden för denna metod?

Det finns olika metoder för att bestämma glukoskoncentrationen i blodet, men glukosoxidas är det mest exakta. Bottom line är att samspelet mellan socker och syre i luften oxiderar reagenset. Väteperoxid frigörs i lösningen. Detta ämne interagerar med ortotoluidin och bildar en färgad förening. För beteendet hos denna reaktion krävs närvaron av speciella enzymer. Glukosoxidas måste vara närvarande i oxidationsreaktionen och peroxidas vid färgningen av vätskan. Färgens intensitet beror på glukosinnehållet och är mest intensivt med högt innehåll.

Kärnan i glukosoxidasmetoden för bestämning av glukos

Utvärdering av resultatet sker med hjälp av den kvantitativa metoden för fotometri vid samma tidsintervall. Var noga med att använda en kalibreringslösning som innehåller en viss angiven sockerhastighet och med utgångspunkt från det kan du döma koncentrationen av glukos i kroppsvätskorna, ofta i blodet.

Hur gör analysen?

Materialet tas från patienten i en tom mage. För testet med användning av venöst blod i en mängd av 5 ml. På tröskeln till diagnosen visas patienten en strikt diet. Detta kommer att göra det möjligt att bedöma resultatet av tillförlitligheten och utesluta eventuella analysfel. 2 dagar före blodutslaget måste patienten ge upp de dåliga vanorna att dricka och röka. Det är också nödvändigt att begränsa intaget av alltför söta rätter och om möjligt undvika stressiga situationer.

Oftast utförs denna metod för bestämning av glukoskoncentrationen genom centrifugeringsmetoden, vilken används för att separera de formade elementen. Mängden socker bestäms i plasma. När alla nödvändiga reagens tillsätts till det, observeras färgen efter 20 minuter om testet utförs vid rumstemperatur. Beräkning av glukosnivå utförs enligt kalibreringsschemat eller med användning av delregeln.

Reagenser för forskning

För att bestämma sockret är det mest lämpligt att använda snabba metoder för bestämning av glukos i blodet. Detta beror på enkel användning och snabba resultat. Dessutom behöver patienten inte gå till laboratoriet eller sjukhuset. Men till skillnad från glukosoxidas testet är en sådan diagnos opålitlig. Eftersom det inte skiljer glukos från andra sockerarter och bestämmer deras koncentration tillsammans.

Grunderna för glukosoxidasreaktionen är natriumklorid 9% lösning och zinksulfat 50%. De tillsätts vid blodcentrifugeringstrinnet. Använd dessutom en buffertlösning med ättiksyra och natriumacetat. Titreringsmetoden bestämmer dess pH vid 4,8. Därefter tillsätts glukosoxidas, vilket medför väteperoxid och peroxidas, vilket är involverat i färgning av lösningen till önskad koncentration för erhållande av ett korrekt resultat.

Standarder under analysen

Mängden socker mäts i speciella enheter - millimol per liter lösning.

Blodprov på glukosoxidas måste utföras på tom mage och plasma eller serum används för detta. Antalet för vuxna för både kvinnor och män är 3,3-5,5. För barn under 15 år är denna siffra något lägre och varierar mellan 3,2 och 5,3. Hos nyfödda är blodglukosen 1,7-4,2. Ökningen i prestation observeras med utvecklingen av en patient med diabetes mellitus eller i strid med glukostolerans. Detta tillstånd är en prediabetes, och om den inte behandlas i tid, så kommer det snart att leda till utvecklingen av denna allvarliga patologi.

ARBETSNUMMER 1. KVANTITATIV BESTÄMNING AV GLUKOS I BLODET. ENZYMATISK (GLUCOSOOXIDAL) METOD

RATIONAL FÖR UTFÄRDANDE AV ARBETET. Bestämning av glukos i helblod eller plasma utförs i varje patient för att bedöma tillståndet av kolhydratmetabolism och diagnostisera patologi (hyperglykemi, hypoglykemi). En enzymatisk metod baserad på oxidation av glukos med glukosoxidas till glukonsyra i närvaro av syre används för bestämning av blodglukosinnehållet. Metoden är mycket specifik för bestämning av D-glukos i närvaro av andra reducerande substanser innehållna i vävnadsextrakt och biologiska vätskor.

PRINCIP FÖR METODEN. Glukosoxidas är ett komplext enzym innehållande FAD som en protesgrupp. När glukos oxideras med glukosoxidas delas två väteatomer av från den första kolatomen i glukosmolekylen. Vidare överförs dessa två väteatomer till FAD, FADH bildas₂. Den senare överför väteatomer till molekylärt syre för att bilda H₂Oh₂. Då H₂Oh₂ den klyvs av peroxidasenzym i vatten och atomsyror, vilket oxiderar kromogenet (färgämnet) som blir färgat under oxidation.

Glukosoxidasmetod

Idag används metoder som är baserade på användningen av enzymet glukosoxidas mest använt. Metoden är baserad på följande reaktion:

Glukosoxidas katalyserar överföringen av två väteatomer från den första kolatomen av glukos till syre upplöst i ett flytande reagens. Under reaktionens gång bildas väteperoxid i ekvimolära mängder. dvs Koncentrationen av väteperoxid bildad är exakt lika med den bestämda koncentrationen av glukos. Följaktligen transformerade användningen av glukosoxidasreaktionen problemet med att bestämma glukoskoncentrationen i problemet med att bestämma koncentrationen av väteperoxid, vilken, som kommer att visas nedan, är mycket enklare än den första. Och här finns det flera metoder som används allmänt idag i laboratoriepraxis (se diagram).

Bland de ovannämnda registreringsmetoderna är den mest använda fotometriska biokemiska metoden, i vilken väteperoxidmolekyler under verkan av enzymet peroxidas delas in i bildningen av den aktiva syreformen - superoxidanjonradikal - O₂ -, som i sin tur oxiderar kromogenet, vilket leder till en signifikant förändring i kromogenets absorptionsspektrum.

Den höga populariteten hos denna metod för att bestämma glukos beror på dess höga specificitet och enkel implementering. Metoden kan implementeras med hjälp av en konventionell fotometer, såväl som att använda automatiska biokemiska autoanalysatorer.

Glukosoxidasmetoden är idag erkänd som en av de mest exakta kvantitativa metoderna för bestämning av glukos. Som ett biologiskt material används som serum och helblod. När man arbetar med den senare bör man ta hänsyn till det faktum att när kapillärt blod tas, beror andelen serum (plasma) på hematokritvärdet, som kan påverka resultatet noggrannt. Därför är det föredraget att använda patientens serum vid bestämning av glukosen med förfarandet som beskrivits ovan.

Tillsammans med den slutpunktsfotometriska metoden för flera år sedan uppträdde kits där den kinetiska fotometriska metoden implementerades. Kärnan i metoden är att vid ett visst förhållande mellan glukosoxidas och peroxidas aktivitet, kommer bildningsgraden av en färgad förening under en tid efter tillsats av provet till arbetslösningen att vara proportionell mot glukoskoncentrationen i provet. Fördelen med denna metod är att resultatet inte beror på närvaron av andra föreningar i provet, eftersom absorptionen av den senare är stabil över tiden. Denna metod kräver användning av en kinetisk fotometer, halvautomatiska analysatorer eller automatiska biokemiska analysatorer. Mätningen av glukoskoncentrationen från helblod utförs lämpligt med hjälp av instrument vars funktion är baserad på den amperometriska mätprincipen med användning av speciella enzym sensorer. Väteperoxid är en extremt instabil kemisk förening, och den kan fungera som en källa till laddade partiklar. Detta är det som används i enzym-sensorer av membrantypen eller i elektrokemiska element av bärbara glukometrar.

Sammanfattningsvis bör vi nämna nackdelarna med glukosoxidasmetoden. Den resulterande väteperoxid- och superoxidanjonradikalen kan oxidera inte bara kromogenet utan även andra substanser närvarande i den biologiska vätskan: askorbinsyra, urinsyra, bilirubin. Samtidigt minskar andelen peroxid, som deltar i oxidationen av kromogen, vilket leder till en underskattning av glukosresultatet. Denna metod är linjär, som regel upp till 20-30 mmol / l glukos.

Kvantitativ bestämning av blodglukos genom glukosoxidasmetoden

Principen för metoden. Metoden är baserad på specificiteten av verkan av enzymet glukosoxidas. Detta enzym oxiderar glukos i närvaro av molekylärt syre för att bilda glukonolakton, som spontant hydrolyserar till glukonsyra. Glukosoxidas oxiderar glukos för att bilda väteperoxid (H₂Oh₂), som under verkan av peroxidas reagerar med 4-aminoantipyrin och fenol. Resultatet är en rosa färgad förening, vars optiska densitet vid 510 nm är proportionell mot koncentrationen av glukos i provet.

2 N₂Oh₂ + 4-aminoantipyrin + fenol → kinonimin + 4H₂Oh

utrustning: KFK, centrifug, termostat, stativ, provrör, pipetter, biologiskt material, reagenser som ingår i arbetslösningen.

prov, ml

standardprov, ml

singeltest (N₂O), ml

Kalibreringsglukoslösning (standard)

Rören inkuberas i en termostat vid 37 ° C i 15 minuter och färgas sedan med ett grönt filter i ett grönt filter i kyvetter med en skikttjocklek av 5 mm mot ett ämne (H₂O). Rosa färg är stabil i 1 timme efter inkubation.

beräkning glukosinnehåll producerat med formeln:

C = x C-standard, var

C är glukosinnehållet i försöksprovet, mol / l;

Eop är provets optiska densitet;

Est är den optiska densiteten hos kalibreringsprovet;

С standard - innehåll i kalibreringslösning, mol / l.

Normala värden:  nyfödda - 2,8-4,4 mmol / l

 barn - 3,9 -5,8 mmol / l

 Vuxna - 3,9 - 6,2 mmol / l

Hypoglykemi (HGH). Ökningen i blodglukos beror på många orsaker, enligt vilka det finns två grupper av hyperglykemi.

1. Insulär - associerad med otillräckligt innehåll i insulinets kropp eller på grund av ineffekten av dess verkan.

2. Extrainsulär (extrainsulär) - Beroende inte på effekten av insulin.

Följande förfaranden är mest signifikanta vid bildandet av HGH: förbättrad glykognedbrytning; ökad neoglukogenes; inhibering av glykogensyntes; minskning av glukosutnyttjandet av vävnader som påverkas av hormonella antagonister av insulin: somatotropin, glukortikoider, tyroxin, tyrotropin.

Alimentary hyperglykemi noteras med överdriven glukosförsörjning i blodet (till exempel hyperglykemi under sockerbelastning). Hepatisk hyperglykemi förekommer i diffusa läsningar i levern.

Persistent och svår hyperglykemi följer oftast diabetes mellitus. Det är vanligt att isolera insulinberoende diabetes mellitus och icke-insulinberoende diabetes mellitus, respektive diabetes mellitus typ I och diabetes mellitus typ II. Bildandet av diabetes mellitus typ I är huvudsakligen associerat med nedsatt syntese och utbyte av insulin.

Den andra gruppen av hyperglykemi är huvudsakligen associerad med hyperfunktionen hos de endokrina körtlarna som producerar hormoner - insulinantagonister. Det observeras vid sådana sjukdomar som syndromet och Cushings sjukdom, akromegali, tyrotoxikos, feokromocytom, glukogenom. Blodglukosnivåerna ökar också i vissa leversjukdomar (i synnerhet hos 10-30% av patienterna med levercirros), hemokromatos (pigmenterad cirros av levern, bronsdiabetes).

Hypoglykemi (HGP) - minskning av blodsocker - oftast förknippad med en absolut eller relativ ökning av insulinhalterna i blodet. Vnepankreaticheskim hypoglykemi observerades som ett resultat av en obalans mellan omfattningen processerna för glykogenolys och glukoneogenes i levern under akut och kronisk hepatit, cirros, akut och subakut leversjukdom, alkoholförgiftning, förgiftning genom arsenik, fosfor, under långvarig mekanisk gulsot, kronisk lever, primär eller metastatisk levercancer. Sänka blodglukoskoncentrationer observeras ofta hos patienter med esofageal cancer och andra maligna tumörer vnepankreaticheskim lokalisering (fibrom, fibrosarkom, neurom), såväl som okontrollerbara kräkningar, anorexi, hepatisk diabetes, uremi, riklig laktation och glykosuri hos gravida kvinnor.

Hypoglykemi kan vara av centralt ursprung på grund av mentalt trauma, encefalit, subaraknoid blödning, hjärntumör.

1. Ärftliga störningar av kolhydrat digestion.

2. Vilka typer av hyperglukos är kända för dig?

3. Vad är orsakerna till patologisk hyperglukosemi?

4. Vad är orsaken till insulinberoende diabetes mellitus?

5. Vilka är de biokemiska orsakerna till ärftliga sjukdomar: a) glykogenos? b) aglykogenos? c) fruktosemi? d) galaktosemi?

6. Vilka är de biokemiska förändringarna i kolhydratmetabolism under fastande?

7. Principen för metoden för bestämning av glukostolerans.

Glukosoxidas och hexokinasmetoder för bestämning av serumglukos i blodet

Noggrann diagnos, föreskrivande behandling kräver en serie laboratorietester.

Metoden för bestämning av serumglukos är det viktigaste verktyget för detektering av hyper- och hypoglykemi hos patienter med diabetes mellitus.

Metoden gör det möjligt att justera metaboliska störningar i medicinsk terapi. Diagnostiska glukosnivåer kan också bestämmas i helblod och dess plasma.

Metoder för bestämning av blodglukos

Metoder för att bestämma mängden glukos i blodet utvecklades mycket.

Vissa av dem (reduktionsometriska, kolorimetriska) används praktiskt taget inte på grund av hög toxicitet och låg noggrannhet av resultaten.

De vanligaste enzymstudierna. Glukosoxidasmetoden är en metod för färgreaktion som uppstår när kolhydrater värms upp. Hexokinas bestämmer blodets aktivitet på hexokinas.

Glukosoxidasmetod

Glukosoxidasmetoden för bestämning av blodglukos baseras på dess oxidationsreaktion under inverkan av ett enzym. Detta bildar väteperoxid, det fläckar substansen Chromogen, vars koncentration bestämmer mängden glukos.

Glukosoxidasmetoden används för:

ärftlig fruktosintolerans
pentosuria;
laktulosintolerans.

Nackdelen med studien är att väteperoxid kan oxidera både kromogen- och askorbinsyra, urinsyra och bilirubin närvarande i blodet. Beräkna mängden glukosfotometrisk metod, färgens intensitet jämförs med kalibreringsgrafen.

Under laboratorieförhållanden kan nivån av ett ämne bestämmas:

i venöst blod. Automatiska analysatorer används;
i kapillärblod. Staketet utförs från ett finger.

Den elektrokemiska metoden består av att använda elektroder innehållande glukosoxidas. Mängden genererad väteperoxid eller den återstående nivån av syre som förbrukas under oxidationsprocessen bestäms.

Hexokinasmetod

Ämnet är det viktigaste enzymet för glukosmetabolism, vilket begränsar processens hastighet i celler.

Under laboratoriebetingelser, under verkan av hexokinas, fosforyleras glukos av adenosintrifosfat.

Som ett resultat av reaktionen bildas organiska molekyler, vars mängd bestäms av nivån av ljusabsorption i ultraviolett zonen. För snabb positiv hexokinasreaktion kan också vara ett tecken på förekomsten av maligna tumörer.

Förberedelse för analys

Blodserumglukosprov är föreskrivna för:

Före analysen måste du följa ett antal villkor så att resultaten är så tillförlitliga som möjligt:

forskning utförs på tom mage. Material tas på morgonen;
ett par dagar före diagnosen är det nödvändigt att undvika tung fysisk ansträngning, stress;
I patientens dagliga kost måste det finnas minst 150 gram kolhydrater. Med en brist ökar glukosnivån, och den faller långsamt vilket förvränger dataanalysen.
dagen före diagnosen kan inte röka och dricka alkoholhaltiga drycker;
Det är omöjligt att genomföra forskning efter tunga operationer, förlossning, i närvaro av inflammationer. Kontraindicerat vid analys av levercirros, förvärring av sjukdomar i magen, tumörprocesser;
några dagar före studien, bör man inte genomgå fysioterapeutiska procedurer, ta orala preventivmedel, diuretika, psykotropa läkemedel, koffein.

Analysen kan ge ett falskt positivt resultat i hypokalemi och endokrina sjukdomar (Cushing syndrom, tyrotoxikos).

Norm av glukos i blodserum efter ålder

Normala indikatorer beror på ålder:

sladdblod kan innehålla från 2,5 till 5,3 mmol / l;
hos prematura barn - från 1,1 till 3 mmol / l;
barn på livets första dag - från 2,22 till 3,33;
vid en ålder av 2,7 till 4,4;
hos barn över 6 år - från 3,3 till 5,5 mmol / l;
hos vuxna upp till 60 år - från 4,4 till 6,3;
hos äldre - från 4,6 till 6,1 mmol / l.

Hypoglykemi hos vuxna diagnostiseras med glukosvärden mindre än 3,3 mmol / l och hyperglykemi - mer än 6,1 mmol / l.

Glukosoxidasmetod för bestämning av glukos i plasma

Vi är glada att välkomna dig på webbplatsen www.unimedao.ru!

Tack för att du svarat på vår fråga.

19.11.2009

Gerasimenko V.A., Ph.D., Kurilyak O.A., Ph.D.

Från arkivet av tidningen "News A / O Unimed"

Bestämning av glukoskoncentration i blodet är en av de vanligaste biokemiska studierna i QDL. Orsaken till testets exceptionella popularitet är förknippad med en hög förekomst av diabetes. Detta test utförs både inom kliniska och ambulanta kliniker. Patienter med diabetes är tvungna att undersöka blodsockernivån i hemmet, för utan denna information är det svårt för dem att justera kost, motion, användning av insulin och andra antidiabetika. Den exceptionella betydelsen av testet och de stora volymerna av utförd forskning har stimulerat utvecklare att skapa olika typer av enheter och metoder för bestämning av glukoskoncentrationen i blodet.

För närvarande finns det många metoder för att bestämma glukos. De kan klassificeras enligt följande.

Metoder för bestämning av glukos i serum

- slutpunkt fotometrisk

- reflekterande fotometri - torr kemi

De två första metoderna är extremt obekväma, giftiga och har låg noggrannhet, så vi kommer inte att bo på dem.

Glukosoxidasmetod

Idag används metoder som är baserade på användningen av enzymet glukosoxidas mest använt. Metoden är baserad på följande reaktion:

I fig. Figurerna 1 och 2 visar arbetslösningens spektra före och efter tillsats av standardglukoslösningen. Den maximala absorptionen av reaktionsblandningen - (reagens + glukos) ligger i området 500 nm. Följaktligen är förändringen i den optiska densiteten hos den slutliga reaktionen vid en våglängd av 480-520 nm proportionell mot koncentrationen av glukos som finns i provet.

Den höga populariteten hos denna metod för att bestämma glukos beror på dess höga specificitet och enkel implementering. Metoden kan implementeras med en vanlig fotometer (bättre än en specialiserad biokemisk fotometer som Mikrolab 540) eller med hjälp av automatiska biokemiska autoanalysatorer.

Tillsammans med den slutpunktsfotometriska metoden för flera år sedan uppträdde kits där den kinetiska fotometriska metoden implementerades. Kärnan i metoden är att vid ett visst förhållande mellan glukosoxidas och peroxidas aktivitet, kommer bildningsgraden av en färgad förening under en tid efter tillsats av provet till arbetslösningen att vara proportionell mot glukoskoncentrationen i provet. Fördelen med denna metod är att resultatet inte beror på närvaron av andra föreningar i provet, eftersom absorptionen av den senare är stabil över tiden. Denna metod kräver användning av en kinetisk fotometer, till exempel Stat Fax 1904+, Stat Fax 3300, halvautomatiska analysatorer, såsom Clima 15, eller automatiska biokemiska analysatorer. Mätningen av glukoskoncentrationen från helblod utförs lämpligt med hjälp av instrument vars funktion är baserad på den amperometriska mätprincipen med användning av speciella enzym sensorer. Väteperoxid är en extremt instabil kemisk förening och den kan fungera som en källa till laddade partiklar. Detta är det som används i enzym-sensorer av membrantypen eller i elektrokemiska element av bärbara glukometrar.

Ett prov av helblod (vanligtvis 20 pl) utspädes i en systembuffertlösning (röda blodkroppar förstörs) och matas sedan genom en linje i en flödescell. Glukos, genomgår oxidation under påverkan av enzymet glukosoxidas, som ligger på membranet. Den resulterande väteperoxiden diffunderar genom membranet och oxideras ytterligare i den katalytiska reaktionen under verkan av platina. Spridningen av väteperoxid på platinens yta bildar en ström proportionell mot antalet molekyler H₂Oh₂. Den sålunda erhållna signalen behandlas av anordningen vid motsvarande spänningsvärde. Detta uppmätta värde är proportionellt mot glukoskoncentrationen i provet.

Som ett exempel på instrument som använder metoden som beskrivits ovan kan vi nämna Biosens glukosanalysatorer (Tyskland). Dessa anordningar är lämpliga för användning inte bara på sjukhus, men också i polykliniker, där glukosprovning sker huvudsakligen från kapillärblod.

Ett viktigt steg i utvecklingen av kliniska laboratoriediagnostiska metoder var framväxten av "torr kemi". Naturligtvis var en av de första tillämpningarna av denna teknik uppgiften att bestämma glukosen i patientens blod. De första enheterna var signifikant underlägsna i noggrannhet gentemot de traditionella laboratorieforskningsmetoderna. Men över tid lyckades ett antal företag utveckla sådana diagnostiska remsor och reflekterande fotometrar, vilket gav en mycket hög noggrannhet i analysen. One Touch glucometers och Life Scan (USA) testremsor är allmänt populära över hela världen. De kombinerar framgångsrikt den analytiska noggrannheten hos den kvantitativa enzymatiska metoden med hastigheten och enkelheten i "torr kemi".

One Touch blodglukosmätare är konstruerade för att snabbt och noggrant mäta glukosnivåer i helblod. One Touch testremsan innehåller alla nödvändiga kemiska komponenter för tvåstegs glukosoxidasmetoden, inklusive enzymerna glukosoxidas och peroxidas, som adsorberas på ett unikt, poröst hydrofilt membran. Resultatet av reaktionen är bildningen av ett färgat komplex. Intensiteten hos den utvecklade färgen registreras med en reflekterande miniphotometer.

Membran testremsan One Touch liknar en svamp med mikroskopiska porer och utför en trippelfunktion. Det verkar: 1) som en behållare, samlar in den önskade blodmängden, 2) som ett filter, blockerar fast cellulärt material (erytrocyter, leukocyter etc.), 3) som en slät optisk yta på vilken reflekterat ljus mäts. Den sistnämnda funktionen är i synnerhet mycket viktig för driften av anordningen. Det gör det möjligt att läsa den nedre delen av remsan medan blodet kvarstår på testremsans övre del. Följaktligen är det inte nödvändigt att tvätta blodet från provremsan.

Dessutom har membranet hydrofila egenskaper, på grund av vilka en bloddropp "lockar" till ytan av testremsan när den berörs.

Enheten One Touch innehåller två speciella lysdioder. Bearbetning av den utvecklade färgen på testremsan är som följer. Så snart testremsan sitter i enheten uppstår en nollavläsning. För tillfället på displayen ser vi: "Vänta". När en bloddropp appliceras på testremsan sorberas blodplasma omedelbart av membranet, medan röda blodkroppar och överskott av plasma förblir på membranets yta. Efter fullständig absorption av en droppe blod uppstår färgning omedelbart. Enheten registrerar förändringen i reflektionens storlek och startar automatiskt timern. Efter 45 sekunder avslutas den kemiska reaktionen, resultatet av ljusreflektionen behandlas. Den färgade reaktionsprodukten absorberar det ljus som emitteras av den första lysdioden. Blodceller och överskott av plasma absorberar också det ljus som emitteras av dioden. För att korrigera bakgrundsreflektionen utförs den andra behandlingen av en andra LED vid en annan våglängd. Skillnaden mellan signalerna från den första och den andra lysdioden bär information om ljusets absorption av kromogen. Den signal som tas emot från kromogen för att uppskatta glukoskoncentrationen är korrelerad med en särskild kalibrering. Alla One Touch-enheter kalibreras med referensmetoden på en laboratorieglukosanalysator. Med denna procedur erhålls en standardkalibreringskurva. Det bör noteras att det är ganska svårt att fastställa produktionen av testremsor, vilket skulle vara absolut samma kemiskt på grund av den mycket låga koncentrationen av reagens. För att lösa detta problem används en standardkalibreringskurva som består av 16 kalibreringslinjer. Kvalitetskontroll utförs omedelbart efter tillverkning av testremsor, vilket gör det möjligt att bestämma vilken av kalibreringslinjerna (från 1 till 16) som kan appliceras på denna testremsa. Det här är det så kallade kodnumret, som är fäst på testremsan. Dessa 16 kalibreringslinjer programmeras också i instrumentets mikroprocessor. För att få optimalt noggranna resultat ställs kodenummeret som anges på testremsans förpackning in i enheten med kodknappen. Således kan en felaktigt installerad kod på instrumentet orsaka ett mätfel.

Sedan införandet av One Touch-enheterna på marknaden har ett stort antal kliniska studier gått i laboratorier i Ryssland, Amerika och Europa. En sådan studie genomfördes av den ryska akademin för medicinsk vetenskaps endocrinologiska vetenskapliga centrum på begäran av den ryska föreningen för medicinsk laboratoriediagnostik. Centrumspecialister genomförde en jämförande analys av två metoder för att mäta blodsockernivån. Resultaten som erhölls på One Touch jämfördes med de data som erhölls på Spectrum II biokemiska analysatorn (Abbott Laboratories, USA), som genomför hexokinasmetoden för bestämning av glukos. 190 blodprover från 95 patienter undersöktes. Korrelationskoefficienten för resultaten var 0,98641. Variationskoefficienten i de normala och patologiska områdena på One Touch-mätaren överstiger inte 2,5%.

Den officiella rapporten från den ryska akademin för medicinsk vetenskaps endokrinologiska forskningscenter säger: "One Touch-enheter har hög noggrannhet och noggrannhet, liksom ett brett utbud av mätningar. De kan användas för att diagnostisera nödförhållanden i diabetes, inklusive akutteam, eftersom dessa enheter inte bara är tillförlitliga, men de ger också snabbt resultat. "

Hexokinasmetod

Registrering utförs vid en våglängd av 340 nm på absorptionen av NADH. Denna metod är mycket specifik och reagerar inte med andra komponenter i blodserum. Hexokinasmetoden anses vara en referens för glukosbestämning. I regel är den linjär till 50 mmol / l, vilket gjorde det möjligt att rekommendera det till kliniker med endokrinologiska avdelningar.

Av de beskrivna olika metoderna för bestämning av glukos kan QDL-anställda själv bestämma vilken bestämningsmetod och vilken apparat som ska väljas:

Metoder för "våt" biokemi, implementerad på automatiska biokemiska analysatorer, kommer att ge laboratoriernas behov ett stort flöde av analyser.
Biosentyp glukosanalysatorer kräver minimal ansträngning från operatören, eftersom de är helt automatiserade och tillräckligt produktiva (hastighet från 50 till 200 prover per timme).
För laboratorier med ett litet antal studier samt expresslaboratorier är en special biokemisk fotometer Mikrolab 540 lämplig.
För hjälpteam är dölj hjälp den perfekta lösningen - blodglukosmätare som One Touch.

Således är uppgiften att QDL för att säkerställa inte bara snabb, men också hög noggrann glukosbestämning, fullständigt lösbar idag.

Blodsocker, urin, sprit

Blodsocker kontrolleras strikt.

Kontroll av glukoskoncentration i blodet utförs av nervpåverkan och hormoner.

Nervös reglering

Den nervösa reglering av glukoskoncentration i blodet uttrycks i den positiva effekten av n.vagus på insulinutsöndring och den inhiberande effekten på denna process av sympatisk innervation. Dessutom är frisättningen av adrenalin i blodet föremål för sympatiska influenser.

Hormonal reglering

De viktigaste hormonella regleringsfaktorerna är glukagon, adrenalin, glukokortikoider, somatotrop hormon å ena sidan och insulin å andra sidan. Alla hormoner, förutom insulin, som påverkar levern, ökar glykemi.

Insulin är det enda hormonet i kroppen som syftar till att sänka blodsockernivån. Med sitt inflytande absorberas glukos starkt av muskler och fettvävnad.

Minskningen av blodglukoskoncentrationen med insulin uppnås på följande sätt:

övergången av glukos till cellerna - aktivering av GluT 4-transportörproteiner på det cytoplasmatiska membranet,
glukosintag i glykolys - en ökning av syntesen av glukokinas, ett enzym som kallas glukosfälla, stimulering av syntesen av andra viktiga glykolysenzymer - fosfofructokranas, pyruvatkinas,
ökad glykogensyntes - aktivering av glykogensyntas och stimulering av dess syntes, vilket underlättar omvandlingen av överskott av glukos till glykogen,
aktivering av pentosfosfatvägen - induktion av syntesen av glukos-6-fosfatdehydrogenas och 6-fosfoglukonatdehydrogenas,
ökad lipogenes - inblandning av glukos i syntesen av triacylglyceroler eller fosfolipider.

Många vävnader är helt okänsliga för insulininsatserna, de kallas insulinoberoende. Dessa inkluderar nervvävnad, glasögonskropp, lins, näthinna, glomerulära njurceller, endotelceller, testiklar och röda blodkroppar.

Glukagon höjer blodglukos:

ökning av glykogenmobilisering genom glykogenfosforylasaktivering,
stimulerande glukoneogenes - ökar arbetet hos enzymerna pyruvatkarboxylas, fosfoenolpyruvatkarboxykinas, fruktos-1,6-difosfatas.

Adrenalin orsakar hyperglykemi:

aktivering av glykogenmobilisering - stimulering av glykogenfosforylas,

Glukokortikoider ökar blodglukosen

genom att undertrycka övergången av glukos in i cellen,
stimulerande glukoneogenes - öka syntesen av enzymer pyruvatkarboxylas, fosfoenolpyruvatkarboxykinas, fruktos-1,6-difosfatas.

Tabellen sammanfattar de viktigaste aspekterna av hormonella influenser:

Aktivering av glykogenolys i levern
Stimulering av glukoneogenes;

Ökad glukoneogenes;
Minskad membranpermeabilitet för glukos.

Blodglukos i klinisk praxis

Över 90% av alla lösliga kolhydrater med låg molekylvikt är glukos; dessutom kan fruktos, maltos, mannos och pentos vara närvarande i små mängder, och i fall av patologi, galaktos. Tillsammans med dem i blodet innehåller polysackarider associerade med proteiner.

Speciellt intensivt konsumeras glukos och används för olika behov hos vävnaden i centrala nervsystemet, röda blodkroppar, njurarnas medulla. I intermediär metabolism används glukos för att bilda glykogen, glycerol och fettsyror, aminosyror, glukuronsyra och glykoproteiner. Koncentrationen av glukos i blodet är ett derivat av glykolys och oxidation av trikarboxylsyror i TCA-cykeln, glykogenes och glykogenolys i lever- och muskelvävnad, glukoneogenes i lever och njurar och glukosintag från tarmen.

I klinisk praxis undersöks blodsockernivån vanligen, koncentrationen av andra sockerarter och glykogen används mycket mindre ofta. I humant blod är glukosen ganska jämnt fördelad mellan plasma och bildade element, det har visat sig att sockerhalten i venöst blod är 0,25-1,0 mmol / l (i genomsnitt 10%) mindre än i artär- och kapillärblod. Definitionen av mjölksyra och pyrodruvsyror, aktiviteten hos ett antal kolhydratmetabolismens enzymer, sial- och hexuronsyror, seromucoider, glykosylerad hemoglobin och andra indikatorer är av känt diagnostiskt värde.

Innehållet av glukos i urinen beror på koncentrationen i blodet, även om det utsöndras i både normala och förhöjda blodsockernivåer. Med en ökning av glukoskoncentrationen i blodet övervinns det så kallade njurvärdet (hos friska människor ligger det i området 8,3-9,9 mmol / l) och glukosuri uppträder. Med arteriosklerotisk njure, med diabetes ökar tröskeln och glukosuri kan inte noteras även med en ökning av glukoskoncentrationen till 11,0-12,1 mmol / l.

Metoder för bestämning av blodglukos

Metoder för bestämning av blodglukos är indelade i tre grupper: reduktion, kolorimetrisk och enzymatisk.

Reduktionsmetoder (Man bör komma ihåg att metoderna för denna grupp ger överskattade resultat (ca 20-25%), eftersom blodet innehåller ett antal föreningar som inte är relaterade till kolhydrater, men som har reducerande egenskaper (urinsyra, glutation, kreatinin, askorbinsyra syra)):
- Hagedorn-Jensens titrometriska metod bygger på sockerens egenskaper för att återställa, vid kokning i alkaliskt medium, järn-och-sinus och järnslamat kaliumsalter. Enligt graden av denna återhämtning undersöks koncentrationen av socker i blodet genom titrimetri En viktig fördel med metoden är den låga kostnaden och möjligheten att använda i något laboratorium.
- baserat på reduktionen av nitrobensener, t ex pikrinsyra till pikraminsyra;
- metod baserat på glukos förmåga att reducera kopparsalter. Det resulterande monovalenta koppar verkar som en mellanprodukt. Oxideras av luft syre, det återställer arsen-molybdinsyra eller fosforotungstic syra, som tjänar som sista kromogen.
Colorimetriska metoder. Dessa inkluderar:
- Somodzhi-metod - reduktionsreaktion av koppar, som är i sammansättningen av koppar-ortronreagens, till kopparoxid. Metoden är mödosam, mångsidig, icke-specifik och praktiskt användbar för närvarande inte;
- Folin-Wu-metod - reduktion av koppartartrat till litiumoxid. Metoden är enkel, nackdelen är bristen på strikt proportionalitet mellan intensiteten hos den erhållna färgen och koncentrationen av glukos;
- bestämning av glukoskoncentration enligt Morris och rökdehydratisering av glukos under verkan av svavelsyra och dess omvandling till oximetylfurfural som kondenserar med en arthron i en blå förening. Kräver de renaste reagenserna och strikt vidhäftning till den konstanta reaktionstemperaturen;
- Gultmans ortotoluidinmetod vid modifiering av Khivarinen-Nikkil, som består i att bestämma intensiteten hos lösningsfärgningen som uppträder när en aromatisk aminortoluidin interagerar med aldehydgruppen av glukos i ett surt medium. Denna metod är korrekt och möjliggör en mer bestämd bestämning av glukos.
- Anilinmetoden bibehåller orthotoluidinmetodens känslighet, men är ännu mer specifik.
Enzymatiska metoder:
- baserat på hexokinasreaktionen. Glukos under verkan av hexokinas fosforyleras av ATP, den resulterande Gl-6-F i närvaro av dehydrogenas återställer NADP. Mängden av det senare bestäms av ökningen av ljusabsorption i ultraviolettområdet. Metoden är för dyr för praktiska laboratorier.
- baserat på oxidationen av glukos till glukuronsyra med användning av enzymet glukosoxidas och bildningen under reaktionen av väteperoxid, vilken (i olika versioner):
  - bestämd med kemiska medel;
  - med deltagande av peroxidas, oxiderar den färglös ortotolidin, omvandlar den till en grönblåfärgad förening, räkenheten hos färgberoendet av glukoskoncentration förblir i intervallet från 1,1 till 22 mmol / 1;
  - i närvaro av fenol med deltagande av peroxidas oxiderar 4-aminoantipyrin till en färgad crimsonfärgad förening;
  - i närvaro av kopparjoner oxiderar den fenolftalin till fenolftalein, som är rödfärgad under alkaliska förhållanden.
Elektrokemiska metoder som använder elektroder som innehåller immobiliserade enzymer, i synnerhet glukosoxidas. Reaktionen registreras av mängden väteperoxid som bildas eller genom förlust av syre som förbrukas för oxidation av glukos.
Diagnostiska remsor med användning av glukosoxidas-peroxidasreaktionen och bensidinderivat som kromogen.

Tre metoder antogs som förenade: Haggedorn-Jensen-titrometrisk metod, orto-toluidinmetoden och o-tolidin-glukosoxidasmetoden.

Bestämning av glukos genom ortotoluidinmetoden

principen

Glukos när den upphettas med ortotolud i närvaro av svavelsyra ger en blågrön färg.